第七周周四生物化学の第十六章RNA生物合成(转录).

Wang-KaiFang,PhD（方王楷）[e-mail]ryandMolecularBiologyShantouUniversityMedicalCollegeChapter16Transcription转录（transcription）生物体以DNA为模板合成RNA的过程。转录RNADNACentralDogma描述遗传信息流动的方向1958年DNA双螺旋发现者F.crick提出中心法则1970年H.Temin对中心法则进行了补充转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录RNA合成：1.DNA指导的RNA合成2.RNA指导的RNA合成（RNA复制）由RNA依赖的RNA聚合酶催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。转录与复制的相似点：1.模板均为DNA；2.都需依赖DNA的聚合酶3.延长机理都是形成磷酸二酯键；4.方向均为5′→3′;5.遵从碱基配对规律。酶促的核苷酸聚合过程转录和复制的区别复制转录模板DNA双链DNA的一条链原料dNTP(N=A、G、C、T)NTP(N=A、G、C、U)引物需要不需要酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物DNARNA配对A-T、G-CA-U、T-A、G-C参与转录的物质原料:NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）模板:DNA酶:RNA聚合酶（RNApolymerase,RNA-pol）其他蛋白质因子及Mg2＋和Mn2＋等转录的模板和酶TemplatesandEnzymes第一节一、转录模板5'3'3'5'结构基因（structuralgene）不对称转录(asymmetrictranscription)在DNA分子双链上某一区段，一股链可转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一单链上。template3’5’5’3’3’3’5’5’5’3’3’5’转录产物RNA的碱基序列，除了T变U外，其余与编码链相同。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译二、RNA聚合酶（DDRP）1.原核生物的RNA聚合酶E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的六聚体（2）核心酶（coreenzyme）全酶（holoenzyme）molecularweight:480kdE.coliRNA聚合酶组分亚基分子量功能36512决定哪些基因被转录150618催化聚合反应155613结合DNA模板，解旋70263辨认起始点其他原核生物的RNA聚合酶，在结构、组成、功能上均与E.coli相似。原核生物的RNA聚合酶都受一类抗结核药利福平或利福霉素的特异性抑制。这类药物能与RNA聚合酶的亚基特异结合，从而影响酶的活性。RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合2.真核生物的RNA聚合酶种类IIIIII转录产物45S-rRNA(28S,18S,5.8S)hnRNA5S-rRNAtRNA,snRNA对鹅膏蕈碱的反应不敏感极敏感中度敏感RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都由多个亚基组成。有些亚基是三种酶所共有。mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的，需经常重新合成。因此RNA聚合酶Ⅱ是三种酶中最活跃的。CTD:羧基末端结构域，为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重复序列三、模板上酶的辨认、结合转录是不连续、分区段进行的。原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。5335结构基因调控序列RNA-polRNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。是调控转录的关键部位。RNA聚合酶保护法40－60bpN17TTAACTN7AN16TATGATN7AN17TATGTTN6AN16TATAATN7AN18TACTGTN6ATTTACATTTACATTGACATTGATACTGACGtrptRNATrplacrecAara－　区－　区3510+1最大一致性TTGACATATAATx/45383629373728402530412944原核生物基因操纵子转录上游区段碱基序列分析开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点(recognitionsite)55RNA聚合酶保护区结构基因33TATA盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件结构基因-GCGC---CAAT---TATA转录起始真核生物启动子保守序列转录过程ProcessofTranscription第二节分为三个阶段：起始(initiation)延长(elongation)终止(termination)一、原核生物的转录过程（一）转录起始转录起始需解决两个问题：1.RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。2.DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。2.DNA双链解开。→开放转录复合物1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合物。3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+PPi转录起始过程四磷酸二核苷酸PPi5’3’3’5’HOOHHOHHCH2P~P~POHOOHHHOHHCH2-OPOO5’3’3’5’HOOHHHOHHCH2P~P~POHOOHHHOHHCH2P~P~POcodingstrandtemplatestrandOOOORNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物（二）转录延长1.亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi转录泡（transcriptionbubble)5’5’5’17bpRNApolymerasedirectionoftranscriptioncodingstrandNewRNAstrandtemplatestrandpppGRNA-DNAhybridunwindingrewinding8bpG≡CA＝TA＝U转录泡（transcriptionbubble）：在转录延长过程中，由局部打开的DNA双链、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者结合在一起的复合体，为空泡状结构，又称转录复合物。53DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶转录未完成，翻译已开始进行(三)转录终止RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类：依赖Rho(ρ)因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止1.依赖ρ因子的转录终止因子是同六聚体蛋白（亚基分子量46KD）；因子能结合RNA，与polyC的结合力最强；因子还有ATP酶和解螺旋酶的活性。1969年，J.RobertsT4噬菌体DNA感染大肠杆菌2.解螺旋酶活性使DNA/RNA杂化双链解开1.使RNApol构型象改变，停止转录2.不依赖ρ因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构茎环结构使转录终止的机理•使RNA聚合酶变构，转录停顿；•使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5´pppG5335RNA-polrU/dA配对不稳定二、真核生物的转录过程（一）转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒增强子顺式作用元件(cis-actingelement)1.转录起始前的上游区段AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚体启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远隔序列（转录起始点）（-100～-40nt）（-50000～-100nt）2.转录因子能直接或间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为通用转录因子(basaltranscriptionalfactors,TF)。参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ转录因子亚基和(或)分子量（kDa）功能TFⅡDTBP，38结合TATA盒(700KD)TAF(8~10个)辅助TBP-DNA结合TFⅡA12，19，35稳定ⅡD-DNA复合物TFⅡB33促进RNA-polⅡ结合TFⅡF30，74解螺旋酶TFⅡE57()，34(β)ATPaseTFⅡH蛋白激酶，使CTD磷酸化CTD:羧基末端结构域，为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重复序列3.转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化转录的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化上游因子与启动子上游元件结合的蛋白质。调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合及起始复合物的形成，协助调节基因的转录效率。可诱导因子与增强子等远端调控序列结合。在特定时间和组织中表达而影响转录。4.拼板理论(piecingtheory)一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。少数几个反式作用因子（可诱导因子和上游因子）的搭配启动特定基因的转录（二）转录延长真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小体转录延长中的核小体移位转录方向核酸酶RNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点55333加尾AAAAAAA······3mRNA（三）转录终止——和转录后修饰密切相关。真核生物的转录后修饰Post-transcriptionalmodification第三节几种主要的修饰方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.修饰(modification)4.添加(addition)一、mRNA的转录后加工(一)首尾的修饰5´-端加帽：m7GpppG—