第七章_花药培养和花粉培养.

安徽大学《细胞工程》精品课程陈勤第七章花药培养和花粉培养安徽大学《细胞工程》精品课程陈勤主要内容花粉和花药培养技术花粉和花药培养应用(1)掌握花药培养和花粉培养的区别(2)了解花药最佳接种时期(3)掌握花药培养的大致过程(4)掌握花粉发育的四种途径(5)掌握花粉培养的大致过程教学目的与要求胚珠花的结构花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养；花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株。单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种重要手段。一、概述安徽大学《细胞工程》精品课程陈勤植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞(haploidcell)。花粉和花药的培养(pollenandantherculture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫做单倍体植物(haplobiont)。一、概述花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。花粉和花药培养的研究意义诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期有利于筛选隐性突变体，提高选择效率获得无病毒个体有利于隐性基因控制性状的选择快速获得自交系的超雄株单倍体植株育种花药培养简史1964年：印度学者古哈(Guha)和马斯瓦瑞（Maheswari）将南洋金花花药培养发育成胚1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植株1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。构建永久性分离群体－双单倍体系（Doubledhaploid)，用于基因定位。双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。花药培养与单倍体育种大大缩短育种周期通过多次自交或近交获得的几乎是同质结合的品系单倍体植株再通过某种手段使染色体组加倍（如秋水仙素处理）从而使植物恢复正常染色体数确定取材时间选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5～15cm，颖片（禾本科植物小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件来判断。二、花药培养技术水稻花药培养旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍剥去旗叶鞘，取出稻穗左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中70％酒精，洗2遍用接种环接种到培养基上培养5天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。注意事项光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。花药培养的条件①花粉发育时期是影响培养效果的重要因素在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦)或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。1、影响花药诱导频率的因素②花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响很大例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化程度高。③培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度较低。随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出愈率。以马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地应用于小麦花药培养，效果良好。培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径一般在禾本科植物中，常用1～5mg/L2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加2～10倍。一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生长无妨碍。最适蔗糖浓度：烟草的为3％水稻为3％～6％玉米则为12％～15％在培养基中加入活性炭能促进花药培养水稻的柱头-花药以1～5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。例如，在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同。2、低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率小麦要求先高温培养64天之后，再转入28～30℃下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。培养温度是影响花药反应的一个重要因素3、花药培养过程花药材料的选取关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。黄心乌花药培养甜椒花药培养草莓花药愈伤组织再生植株花药植株杜兰小麦的花药培养A花药在BAD-3诱导下，3周后形成胚状体和愈伤组织B另一个花药在BAC-1培养基中已愈伤组织中长出叶片C更多的花药在BAD-3培养基上诱导出愈伤组织与子叶D从BAC-1转移到BAD-1分化培养基中形成的愈伤组织E在MS培养基中培养5-6周，愈伤组织开始分化根和绿色的新芽F在MS培养基中培养7-8周，可形成大量的根和幼茎G在MS再生培养基中培养8周后，可由最初的花药形成小植株H由花药形成的健壮小植株I花药形成的植株在同样的MS再生培养基中生长，可因培养条件改变而形成不正常的植株花粉植株染色体可自发加倍人工措施染色体加倍传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24～96h。浸泡试管苗方法处理芽方法浸根方法单倍体植株的二倍化花药培养脱毒1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L毛曼陀罗花药培养，并诱发再生植株三、花粉培养花粉培养成苗途径与花药培养比较:相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径不同点：花粉培养：需进行花粉的分离特殊的花粉诱导培养一、花粉培养的操作过程选幼年玉兰树花蕾取下花蕾（镜检）预培养数天取花药接种分离花粉药壁向花粉提供营养物质通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质过滤离心再生低温预处理消毒二、培养基1.基本培养基2.激素种类和浓度3.蔗糖浓度1、基本培养基MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养细胞分裂素可促进胚状体形成生长素可诱导愈伤组织形成细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗2、激素种类和浓度较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗3、蔗糖浓度三、单倍体植株染色体加倍的方法单倍体植物天然发生的途径：孤雌生殖无配子生殖孤雄生殖也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体，如黄瓜是指配子体可以不经过配子的结合而直接产生孢子体的，如蕨类植物是指由雄性配子直接进行胚胎发育成新个体。通常由杂交或实验处理后获得的，自然界中很少发生单倍体植株染色体加倍的方法1、自然加倍2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。3、愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。①花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养。②花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。③花药培养包括：选择材料、消毒、接种培养、愈合组织生成、分化出单倍体植株。④花粉的发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育。⑤花粉培养包括花粉的分离、预处理、培养过程。小结思考题花药培养的研究意义花药培养方法谢谢观看!