自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响

自然霉变玉米对仔猪肠道微生态的影响（雷晓娅陈代文毛湘冰毛倩陈洪张玲段绪东余冰）玉米等饲料原料在田间及贮运过程中均容易发生霉变，动物摄入含霉菌毒素的饲料后，会出现生产性能下降、胃肠道功能紊乱、机体氧化损伤、免疫抑制和抗病力减弱等毒性效应，给养猪业带来严重的危害；同时，残留在动物产品中的霉菌毒素及其代谢产物可以通过食物链而危害人类的健康。大量研究表明，霉菌毒素会降低动物的采食量和日增重。胃肠道既是养分消化吸收的主要部分，也是抵御摄入天然毒素的第一道屏障。有研究表明，霉菌毒素会损伤动物肠道结构，降低养分消化吸收。动物消化道内存在大量微生物，肠道微生物区系的平衡对于动物的健康起着非常重要的作用，当动物摄入被霉菌毒素污染的饲粮后对肠道微生物区系有什么样的影响，还未见报道。因此，本试验旨在从肠道形态结构和微生态环境变化两个方面考察自然霉变玉米对仔猪生长性能和肠道健康的影响，并通过采食量配对组的设定来进一步剖分效应产的可能原因。1材料与方法1.1试验设计试验设3个处理，分别为对照组（饲喂玉米—豆粕型基础饲粮）、霉变玉米组（饲喂由自然霉变玉米100%替代基础饲粮中正常玉米的饲粮）和采食量配对组（饲喂基础饲粮，采食量与霉变玉米组相同），每个处理5个重复，每个重复1头仔猪。试验期21d。霉变玉米为自然霉变所得，经检测主要为黄曲霉毒素B1（AFB1）污染，含量为216.52μg/kg；其营养成分为：粗蛋白质12.42%，能量16.90MJ/kg，钙0.0287%，磷0.3027%。1.2试验饲粮基础饲粮为正常玉米—豆粕型饲粮，参照美国NRC（1998）5~10kg仔猪的营养需要标准配制，为粉料。基础饲粮组成及营养水平见表1.将基础饲粮中正常玉米用霉变玉米100%替代后构成霉变玉米组饲粮。表1基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）%项目含量原料玉米55.3膨化大豆12.00去皮豆粕11.00大豆浓缩蛋白5.00进口鱼粉3.00乳清粉6.00蔗糖3.00氯化胆碱0.10食盐0.25脂肪粉1.50石粉1.08磷酸二氢钙0.73L-赖氨酸盐酸盐0.40DL-蛋氨酸0.05苏氨酸0.15色氨酸0.04复合多维1）0.05香味剂0.05微量元素混合料2）0.30合计100.00营养水平消化能（MJ/kg）14.73粗蛋白质19.54钙0.80总磷0.59有效磷0.41可消化赖氨酸1.25可消化蛋氨酸0.34可消化苏氨酸0.79可消化色氨酸0.231）为每千克饲粮提供：VA32.5MIU，VD38MIU，VE80g，VK310g，VB225g，VB612g，VB12120mg，叶酸3g，烟酸100g，生物素500mg，泛酸50g。2）为每千克饲粮提供：Fe120mg/kg，Cu15mg/kg，Mn50mg/kg，I0.3mg/kg，Zn120mg/kg，Se0.3mg/kg。1.3饲养管理15头28日龄断奶仔猪经7天适应期后，按体重相近的原则随机分为3个处理，每个处理5个重复，每个重复1头仔猪，饲养于代谢笼中，自由饮水，每天饲喂4次（8：00,12:00,16:00,20:00），每次以采食后料槽略有少量余料为度，采食量配对组每次均少量供给，推迟两个小时等霉变玉米组采食完成后计算出采食量，再结算补给应给予的饲料量。试验期间每天记录采食量。猪舍温度控制在26℃~28℃，消毒按常规程序进行。1.4样品采集1.4.1饲料样品按照国标GB/T14699.1—2005《饲料采样法》的要求分别采集粉碎后的霉变玉米和正常玉米以及不同处理饲粮各1kg，再按照“四分法”将样品减少到200g，与-20℃冰箱保存待测。1.4.2十二指肠和空肠在试验第22d早上仔猪麻醉致死剖解后，分离肠道，用生理盐水冲洗干净，剪取十二指肠和空肠前段3~4cm，放入10%福尔马林固定液中，待测肠绒毛形态结构。1.4.3后肠内容物在试验第15d早上喂料后2h，用无菌棉签刺激仔猪肛门，收集仔猪直肠内容物，在试验第22d喂料后2h进行麻醉剖解，于冰面上收集盲肠和直肠内容物，所有内容物液氮速冻后转入-70℃冰箱贮存，待测肠道微生物数量及代谢产物含量。1.5测定指标及方法1.5.1饲料中霉菌毒素含量采用酶联免疫法测定霉变玉米和正常玉米以及各处理饲粮中黄曲霉毒素B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）的含量。按照ROMER试剂盒说明书进行测定。1.5.2生长性能与试验起始、第15d和22d早上空腹称重，计算各阶段平均日增重（ADG）；每天结算采食量，计算各阶段平均日采食量（ADFI）；根据日增重和日采食量计算料重比（F/G）。1.5.3肠道组织形态结构将置于10%中性福尔马林固定液中的十二指肠和空肠组织经脱水、浸蜡、包埋、切片等处理，再经苏木精伊红染色，在光学显微镜下进行观察，每个样品均选择8个典型的视野（绒毛完整、走向平直）测定十二指肠和空肠绒毛长度和隐窝深度，计算绒毛长度与隐窝深度比值。样品在四川农业大学病理实验室测定。1.5.4后肠内容物微生物数量按照OMEGA试剂盒说明书提取盲肠和直肠内容物DNA，采用本试验室HongweiQi等建立的荧光定量PCR方法测定和计算盲肠和直肠中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌以及总菌数量。各菌引物和探针序列见表2.PCR反应体系见表3。SYBRPremixExTaq购自TaKaRa，RealMasterMix（Probe）购自TIANGEN。总菌PCR扩增程序为95℃10s，95℃5s；60~64℃25s，39个循环；大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌PCR扩增程序均为95℃10s，95℃5s；60~64℃25s，49个循环。表2各菌引物和探针序列GenePrimerandprobesequenceProductLength(dp)Lactobacillus126FQ-RSFGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCFQ-RSRGAACAGTTACTCTGACACCCGTTCCTTCFQ-RS-PAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTEscherichiacoli96FQ-DCFCATGCCGCGTGTATGAAGAAFQ-DCRCGGGTAACGTCAATGAGCAAAFQ-DC-PAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCBifindobacterium121FQ-SQFCGCGTCCGGTGTTAAAGFQ-SQRCTTCCCGATATCTACACATTCCAFQ-SQ-PATTCCACCGTTACACCGGGAATotalbacteria200Eub338FACTCCTACGGGAGGCAGCAGEub518RATTACCGCGGCTGCTGG表3各菌PCR反应体系μl项目总菌乳酸杆菌和大肠杆菌双歧杆菌灭菌超氧水4.257.77.2上游引物0.511下游引物0.511DNA111染料6.25探针0.30.8RealMasterMix88EnhancerSolution11合计12.520201.5.5后肠内容物微生物代谢产物含量第二周末直肠及第三周末盲肠和直肠内容物的挥发性脂肪酸采用气相色谱法测定；氨采用比色法测定；挥发性脂肪酸和氨的具体操作步骤参照陈洪的方法测定；乳酸采用化学比色法测定，具体操作参照南京建成试剂盒说明书进行。1.6数据处理结果以平均值±标准误表示，数据处理与分析采用SAS8.2进行，将对照组和霉变玉米组以及霉变玉米组和采食量配对组分别进行t检验，以P0.05作为差异显著性判断标准。2结果2.1霉菌毒素含量玉米及饲粮霉菌毒素含量见表4。可见，霉变玉米主要受黄曲霉毒素B1污染，含量超标，进而导致霉变玉米组饲粮黄曲霉毒素B1也超标，而呕吐毒素和玉米赤霉烯酮可检出，但含量未超标。表4饲料中主要霉菌毒素含量μg/kg项目对照组霉变玉米组霉变玉米正常玉米标准黄曲霉毒素B14.68168.66216.524.11≤10呕吐毒素006373≤1000玉米赤霉烯酮39.5740.914.992.16≤5002.2不同处理对仔猪生长性能的影响不同处理对仔猪生长性能的影响结果见表5。与对照组相比较，霉变玉米组仔猪的平均日增重和平均日采食量在试验前两周及全期均有降低的趋势，但差异不显著（P0.05）。而与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的全期平均日增重显著增加（P0.05），全期料重比则显著降低（P0.05）。表5不同处理对仔猪生长性能的影响项目对照组霉变玉米组采食量配对组初始重/kg8.10±0.338.10±0.337.94±0.42末重/kg18.54±0.5717.20±0.7715.28±0.52前两周平均日增重/g448.86±30.05368.86±47.56352.94±23.19平均日采食量/g664.61±48.22564.71±64.69564.71±25.80料重比1.48±0.021.55±0.051.60±0.08全期平均日增重/ga497.33±22.38433.52±25.00373.61±19.57平均日采食量/g764.90±44.30657.55±60.44657.55±32.30料重比a1.54±0.051.51±0.071.76±0.05注：a表示霉变玉米组与采食配对组间差异显著（P0.05）。2.3不同处理对仔猪肠道形态结构的影响不同处理对仔猪肠道形态结构的影响结果见表6。与对照组相比，霉变玉米组仔猪空肠绒毛长度与隐窝深度的比值显著降低（P0.05）；与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪空肠绒毛长度以及绒毛长度与隐窝深度比值均显著降低（P0.05），隐窝深度显著提高（P0.05）。表6不同处理对仔猪肠道形态的影响(单位：μm)项目对照组霉变玉米组采食量配对组十二指肠绒毛长度322.74±19.81334.97±20.05294.86±17.27隐窝深度311.29±18.74310.49±21.76322.70±27.79绒毛长度/隐窝深度1.05±0.091.11±0.120.94±0.10空肠绒毛长度a339.76±5.05306.45±14.91357.55±2.42隐窝深度a242.33±18.71293.119±18.01229.38±8.38绒毛长度/隐窝深度ab1.45±0.141.06±0.081.57±0.06注：a表示霉变玉米组与采食配对组间差异显著（P0.05）；b表示对照组与霉变玉米组间差异显著（P0.05）。2.4不同处理对仔猪后肠微生物数量的影响不同处理对仔猪后肠菌群的影响结果见表7。从表7中可看出，与对照组相比，霉变玉米组仔猪第三周末直肠内容物乳酸杆菌数以及盲肠内容物大肠杆菌数和乳酸杆菌数均显著提高（P0.05）；与采食量配对组相比，霉变玉米组仔猪的直肠和盲肠内容物中个菌数均无显著差异。表7不同处理对仔猪后肠菌群的影响（cfu/g）项目对照组霉变玉米组采食量配对组第二周末直肠内容物总菌9.975±0.0879.668±0.2599.562±0.144大肠杆菌7.278±0.0477.696±0.1977.236±0.168乳酸杆菌7.384±0.3768.3190.3447.690±0.473双歧杆菌7.486±0.5326.590±±0.5486.715±0.312大肠杆菌/总菌%0.211±0.0324.114±2.7940.819±0.486乳酸杆菌/总菌%0.762±0.4769.248±4.0823.723±2.009双歧杆菌/总菌%1.449±0.9160.578±0.3550.348±0.152第三周末直肠内容物总菌11.109±0.19211.139±0.26810.851±0.141大肠杆菌7.452±0.0818.672±0.5597.444±0.094乳酸杆菌b7.206±0.2308.403±0.2717.666±0.230双歧杆菌7.629±0.3527.304±0.4177.294±0.262大肠杆菌/总菌%0.042±0.0273.707±3.3540.051±0.020乳酸杆菌/总菌%