第七章发酵工艺控制.

第七章发酵工艺控制本章主要内容：1、工业发酵的主要类型2、工业发酵的主要控制参数3、染菌对发酵的影响及防治4、发酵工艺的放大5、发酵过程的自动控制本章重点掌握：菌体浓度、基质、溶氧、PH值、温度、泡沫、CO2等参数对发酵的影响。本章主要内容第一节工业发酵的主要类型•一、按投料方式分•1、分批发酵(batchfermentation)•2、补料分批发酵(fed-batchfermentation)•3、连续发酵(continuousfermentation)。1、分批发酵概念：分批发酵：指将微生物和营养物一次性加入发酵罐中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式，中间除了空气进入和尾气排出，没有物料交换。在分批发酵中，培养基是一次性加入，不再补充，随着微生物的生长繁殖活跃，营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，因此其生长速度将随时间发生有规律性的变化。迟滞期对数期恒定期衰亡期时间细菌数目的对数分批发酵微生物的生长曲线微生物的生长曲线①延滞期主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。缩短延滞期的方法有：增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致、保证培养基适宜的营养浓度。缩短延滞期目的：缩短发酵周期、增加产量和避免染菌。②指数生长期指数期微生物的生理特征：养分空间充足，排出的代谢废物浓度还不影响生长，此期分裂速度最快、代谢活动旺盛、对环境变化敏感。作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳时期。③稳定期特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化。原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累抑制了生长。功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续发酵技术。④衰亡期细胞死亡率增加，明显超过新生率，进入衰亡期。多数发酵在到达衰亡期前就结束。特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶。衰亡期比其它期相对较长。分批发酵优缺点：•优点：①操作简单②周期短③染菌机会少④产品质量易于控制•缺点：①生产能力不是很高②非生产周期较长，使得发酵成本高二、连续发酵1.概念：微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时以相同速度不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状态下生长的培养方式。实验室连续培养系统示意图(a)恒化培养系统(b)恒浊培养系统1容器2控制阀3培养室4排出管5光源6光电池7流出液2.特点：菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度均处于恒定状态。3.连续培养的优缺点优点:①可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定。②能够更有效的实现自动化，降低劳动强度，减少工人与病原微生物和毒性产物接触的机会。③减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时。④由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命延长。⑤容易对过程进行优化，有效提高发酵产率。缺点:①长期连续培养会引起菌种退化，降低产量，发酵周期长染菌机会增加。②对设备、仪器及控制器件的技术要求较高。③粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液中结团，给连续发酵操作带来困难。应用：常用于研究工作中，废水处理、面包酵母、啤酒发酵等工业中。三、补料分批培养概念：补料分批发酵(fed-batchculture，简称FBC)，又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。补料分批培养是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。补料分批培养分两种类型：①单一补料分批发酵：指在开始时投入一定数量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加一种或多种成分的新鲜培养基，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后停止补料，最后将发酵液一次性全部放出。②反复补料分批培养：单一补料的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大容积。2.补料分批培养的优缺点优点：与分批培养相比①解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效应。②可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响；③可用作为控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；④可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。与连续培养相比优点①降低了染菌，避免了遗传不稳定性。②产生菌也不会产生老化和变异等问题，适用范围也比连续发酵广泛。二、按菌体生长与产物形成关系分1、生长关联型•特点：•菌体生长、基质消耗和产物合成大体上呈正比关系（菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关）。如：单细胞蛋白、葡糖酸和酒精发酵2、生长部分关联型产物形成和菌体的生长是部分分开的。菌体生长和产物合成是分开的，糖分既供应生长的能量，又充作产物合成的碳源。发酵过程中有两个时期对糖的利用最为迅速，一个是最高生长时期，另一个是最大产物合成时期。如：柠檬酸和部分氨基酸发酵3、生长无关联型发酵过程分两个阶段特征是产物合成与碳源利用无准量关系；通常产物合成在菌体生长停止及底物耗完后才开始。如：许多抗生素和色素的发酵第二节工业发酵过程的主要控制参数一、物理参数1、温度与温度有关的因素：氧在培养液中的溶解度和传递速率菌体生长速率和产物合成速率测量工具：铂电阻或热敏电阻•2、压力（Pa）与压力高低有关的因素：罐压高低与氧和CO2在培养液中的溶解度有关罐压一般范围：0.2×105～0.5×105Pa测量工具：隔膜法压力表或压敏电阻压力表•3、搅拌转速（r/min）影响搅拌转速的因素：氧和CO2在培养液中的溶解度发酵液的均匀性测量工具：频率计数器或转速表4、搅拌功率（KW）指每立方米发酵液所消耗的功率。5、空气流量（vvm）指每分钟内向每单位体积发酵液通入的空气体积。空气流量一般控制在0.5-1.0vvm6、黏度（Pa.s）测黏度的意义：细胞生长活细胞形态的一项标志；发酵罐中菌丝分裂过程情况。测量工具常用涡轮旋转式粘度计7、料液流量（L/min）控制流体进料的参数。二、化学参数1、pH2、基质浓度（g/L或%）3、溶氧浓度（mmol/L,mg/L）4、氧化还原电位（mv）5、产物的浓度（μg/ml）6、废气中的氧浓度（Pa）7、废气中的CO2浓度（%）三、生物参数1、菌体形态菌体形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。用显微镜观察菌体形态2、菌体浓度概念：菌体浓度是指单位体积培养液中菌体的含量。根据菌体浓度的大小决定适合的补料量和供氧量，同时可判断目的产物的产量是否达到最大量。一、菌体浓度对发酵的影响（1）菌体浓度大小直接影响产物产率一般说，菌体浓度越大，产物产率越大。但是菌体浓度过大反而有副作用：①浓度过大，营养物质消耗过快，可能引起发酵液性质明显改变和有毒代谢产物的积累，从而改变了代谢途径。②对于微生物的产物生成与生长呈部分关联型，如果菌体浓度过大，营养基质大部分用来满足菌体的生长，到产物生产期营养不足导致产率降低。（2）浓度对发酵液溶解氧的影响菌体浓度增加，摄氧率增加，但表观黏度也随之增加，氧的传递速率降低，当摄氧速率大于供氧速率时，溶氧浓度由于不足就会成为限制因素。•为了获得最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。二、菌体浓度的控制控制菌体浓度的措施：通过改变基质浓度及中间补料控制菌体浓度。三、发酵过程菌体浓度的检测常用的方法有：浊度法、干重法、离心称重法或测体积法。浊度法：使用的仪器为分光光度计方法：取发酵液在420-600nm波长范围内测定光密度（OD）值。吸光度要求控制在0.3-0.5范围内，这个范围内发酵液浓度与吸光值正相关，不在此范围内的要稀释发酵液。第四节基质浓度对发酵的影响及控制一、基质浓度对发酵的影响1、基质浓度对菌体生长的影响菌体比生长率与基质浓度曲线图为抛物线形如下图。04812162001020304050基质浓度比生长速率2、基质浓度对产物形成和发酵液特性的影响基质浓度过浓可能会导致以下现象：①①可能会改变产物的代谢方向或产生产物合成的阻遏现象；②②菌体生长过旺，发酵液过于粘稠，菌体细胞消耗能量维持生存环境，用于非生产能量增加。③③基质浓度过大，使发酵液黏度过大，从而影响溶解氧的传递，进而影响菌体的生长和产物的合成。二、基质浓度的控制用中间补料的方法控制基质浓度。有效性进行中间补料，要做到选择恰当的补料内容、补料方式和反馈控制参数。补料内容：指补加的培养基成分。选择限制性的一种或几种成分加以补充。补料方式：指补料时机和补料顺序。补料方式分为：分批补加和连续流加，连续流加又分为等速补料和变速补料等方式。反馈控制参数：指导补料方式的控制参数。直接反馈控制参数:控制碳源、氮源或碳氮比。间接反馈控制参数：溶氧、pH、呼吸熵、排气中二氧化碳分压及代谢物浓度。第五节溶解氧浓度对发酵的影响及控制一、溶氧浓度对发酵的影响•影响耗氧的因素有以下几方面：⑴培养基的成分和菌体浓度显著影响耗氧⑵菌龄影响耗氧⑶发酵条件影响耗氧1、溶氧浓度对微生物生长的影响•微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。•呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所消耗的氧量，以QO2表示，单位为mmolO2／(g干菌体·h)。•耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmolO2／(L·h)。式中r——微生物的耗氧速率，mmolO2／(L·h)；——菌体的呼吸强度，mmolO2／(g干菌体·h)；X——发酵液中菌体的浓度，g干菌体／L。2O(X)rQc2OQ•生长临界氧浓度：P95•各种微生物生长对发酵液中溶解氧浓度有一个最低要求，这一溶解氧浓度称为生长临界氧浓度。培养过程中不需要使溶解氧浓度达到饱和值。一般微生物生长临界氧浓度是饱和浓度的1%-30%。溶氧浓度高于临界溶氧浓度时,对微生物的生长有利（）。判断临界氧浓度溶氧浓度2、溶氧浓度对产物合成的影响产物合成临界氧浓度：微生物产物的合成也有一临界溶氧浓度，称为产物合成临界氧浓度。产物的合成也有一合适的溶解氧浓度，溶解氧浓度太高反而会抑制产物的合成。最佳合成溶氧浓度可能低于最适生长溶氧浓度或生长临界氧浓度，也可能高于最适生长溶氧浓度或生长临界氧浓度。•第一类：有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在溶氧浓度高于或等于生长临界浓度的条件下，产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；•第二类：包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显；•第三类：有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸三种氨基酸最佳合成氧浓度分别为生长临界浓度的0.55倍、0.6倍和0.85倍。•判断：在生产中，要保证最高产物产量，供氧时必须使溶氧浓度大于生长临界溶氧浓度（）。需氧发酵产物合成是不是溶氧愈高愈好,为什么?举例说明。问题二、发酵液溶解氧浓度控制（一）从供氧方面控制氧的传递速率总方程式：•N=KLα（C*-CL）•式中：N---单位体积培养液中的传氧速率，[mol/m3·s]；•KL---以浓度差为推动力的总传质系数（m/s)•α–比表面积（m2/m3)•KLα---以浓度差为推动力的体积传递系数，（s-1）；•CL---发酵液主流中氧的实际浓度，（mol/m3）；•C*---罐中氧分压下溶液中氧的饱和浓度（mol/m3）；•α很难测定，KLα可作为一项，称之为液相体积传氧系数。根据供氧速率公式，凡影响（c*-CL）和KLα的因素都会