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第七章生物芯片技术•生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。世界著名商业杂志《财富》对基因生物芯片领域非常看好，它在其1997年的3月31刊中讲到：“微处理器使我们的经济发生了根本改变、给人类带来了巨大的财富、改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大…...”酵母全基因组基因芯片第一节生物芯片简介1.1生物芯片的定义生物芯片是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。•基因芯片——又称DNA芯片或DNA阵列，是生物芯片的一种类型，它是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量，也可以进行基因突变体的检测和基因序列的测定。1.2基因芯片分析流程基因芯片分析的过程主要包括样品及其标记处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据处理及分析等几个步骤。•基因芯片的理论基础：•传统的Southernblot和Northernblot是将受检测的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针来检测样本中是否存在互补的DNA序列。•基因芯片的核心原理与Southernblot和Northernblot相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的变化。1样品制备2DNA提取3荧光标记4分子杂交5信号检测6点阵分析1.3基因芯片技术的特点1、基因芯片的优点1）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。节省时间，并减少系统误差。2）微型化3）高度自动化4）结果重现性和准确性更高（基因芯片能在同一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析，这样就实现了平行化操作，避免了各种误差，使实验结果具有可比性）2、基因芯片的缺点基因芯片技术体系的建立和使用需要较大的投入。（但是，相对于传统的表达分析技术而言，单个基因分析的成本仍是较低的。）第二节生物芯片的分类2.1按载体材料分类玻璃芯片硅芯片陶瓷芯片玻璃芯片具有易得、荧光背景低、应用方便等优点，目前在国际上广泛使用。2.2按点样方式分类1、原位合成芯片（将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他分子大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸）2、微矩阵芯片（目前应用最广泛的基因芯片之一。具有高密度、制作简便的特点。其是将用PCR或化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针点或喷点的方法直接排列到玻片等载体上，从而制备成芯片。）3、电定位芯片（利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基质、导电玻璃上。）2.3按芯片固定的生物分子类型分类（1）基因芯片或DNA芯片（2）蛋白质芯片（3）芯片实验室（lab-on-chip）将一个实验的各个步骤微缩于一个芯片上芯片实验室（Lab-on-a-chip）或称微全分析系统（MiniaturizedTotalAnalysisSystem,µ-TAS）是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。芯片实验室的特点:其一、集成性。目前一个重要的趋势是：集成的单元部件越来越多，且集成的规模也越来越大。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀（包括主动阀和被动阀），微泵（包括机械泵和非机械泵）；微混合器，微反应器，另外还有微通道和微检测器等。其二、分析速度极快。Mathies研究小组在一个半径仅为8厘米长的园盘上集成了384个通道的电泳芯片。他们在325秒内检测了384份与血色病连锁的H63D突变株（在人HFE基因上）样品，每个样品分析时间不到一秒钟。其三、高通量。其四、能耗低，物耗少，污染小。每个分析样品所消耗的试剂仅几微升至几十个微升，被分析的物质的体积只需纳升级或皮升级。其五、廉价，安全。无论是化学反应芯片还是分析芯片由于上述特点随着技术上的成熟，其价格将会越来越廉价。针对化学反应芯片而言，由于化学反应在微小的空间中进行，反应体积小，分子数量少，反应产热少，又因反应空间体表面积大，传质和传热的过程很快，所以比常规化学反应更安全。2.4按芯片使用功能分类（1）测序芯片（2）表达谱芯片（3）基因差异表达分析芯片一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA测序芯片基因表达谱芯片基因差异表达分析芯片第三节基因芯片的制作固相介质硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、塑料等。靶片段DNA、寡核苷酸、RNA等。探针mRNA，或是以mRNA为模板合成的cDNA。标记物常采用荧光剂（如Cy3、Cy5）；同位素等。3.1用于芯片制作的DNA样品的来源（1）从细胞或组织中提取mRNA后反转录成cDNA文库，经测序及生物信息学分析得到代表各个基因的DNA序列，用PCR扩增技术或DNA固相结合技术来获取人们所期望的各种基因片段；（2）利用基因组测序数据，经生物信息学分析得到代表各个基因的数据，在利用PCR技术或DNA固相结合技术来获取人们所期望的各种基因片段。3.2生物芯片的制作方法生物芯片微阵列的制作技术按照制作方法可分为：原位合成和预合成后点样。原位合成法是由点样系统将探针的组成部分逐步转移到基体上，同时实现探针合成和转移的目的。预合成后点样是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂印或喷涂在基体上。1、原位合成光刻DNA合成法（将半导体工业中的光刻技术和DNA化学合成相结合，把光不稳定保护基团保护的4种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，用少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进行DNA合成。）优点：合成的密度和精度优于后两种方法。缺点：需要花费大量的时间去设计和制造价格很高的照相掩蔽网。1通过光刻掩膜曝光2去保护区域被激活3固相化合成1个碱基4通过另一个光刻掩膜曝光5引入另一个碱基6重复这一步骤2、预合成后点样（1）接触点样法（将样品直接点在基体上）优点：仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器。缺点：每个样品都必须是合成好、经过纯化、事先保存的。2202芯片点样仪•生产商Bio-Rad•性能介绍分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴)，重复性：3um球面精确性：l0um。一次制成芯片数：126块芯片每块玻片点样量82,000个点（2）喷墨法（通过压电晶体或其他推进式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。）该法所需的样品都必须是合成好的纯样品（cDNA、染色体DNA和抗体）。与接触点样法不同之处在于喷嘴不与芯片接触。点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头,分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。玻璃基质基因芯片微点阵制备系统3.3DNA分子在刚性表面的固定制作生物芯片的载体材料必须符合下列要求：（1）载体表面必须适应透射或反射光的测量；（2）使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量；（3）载体应当是惰性的和有足够的稳定性。•基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分子固定于支持物上，并保持探针分子的构像处于自然状态，使探针DNA分子能自由地与样品分子进行杂交。第四节基因芯片的杂交及结果分析4.1探针的标记标记的方法通常是在反转录的底物中加入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标记分子渗入cDNA分子中。mRNA反转录标记方法直接影响DNA芯片分析结果的准确性及重现性。4.2杂交在一定条件下，分子间氢键的断裂与恢复是DNA/DNA、DNA/RNA分子间选择性结合的根本动力，这一过程称之为杂交。与经典分子杂交的区别：1.杂交时间短，30分钟内完成2.可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：靶分子浓度、探针浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度及杂交温度和时间等。4.3芯片结果读取与扫描仪生物芯片的扫读（扫描）是指将与目的DNA（或RNA）杂交后、或与目的抗原、抗体、或受体等目的靶分子反应结合后的生物芯片上成千上万个点阵的生物反应结果阅读出来，转变成为可供计算机处理的数据。荧光标记的生物芯片扫描仪按其原理与结构可以分为激光系统扫描仪和CCD系统扫描仪。•基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统读取。BBACDE放大器数模转换器计算机A:激光器B:滤光片C:二色镜D:反光镜E:关栅基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫基因芯片荧光侦测仪高密度微点阵检测扫描系统高密度微点阵分析软件图象分析系统4.4生物芯片的软件系统与数据处理当从芯片发出的荧光转换成数字输出后，数据文件就被定量和翻译，通过重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个点计算平均密度值，从而完成定量，通过对芯片上实验点和对照点的比较，选出杂交点，并定量。一个完整的生物芯片配套软件应该包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理软件和数据提取或统计分析软件，以及芯片表达基因的国际互联网上检索和表达基因数据库分析和积累。第五节基因芯片的应用1、基因表达分析2、基因型及多态性分析3、杂交测序4、核酸和蛋白质相互作用的研究5、疾病的诊断与治疗6、药物开发7、在营养与食品卫生领域的应用8、在环境科学领域中的应用基因芯片在医学领域的应用一、基因芯片可应用于疾病诊断1）肿瘤的基因诊断例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。2）用于诊断遗传性疾病例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫血的检测芯片3）用于病原体的检出和确定例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。二、用于组织配型例：上海复旦长江生物医药股份有限公司开发了HLA分型芯片，目前已在国内各大血站投入应用。三、药物研究检测与疾病相关的基因,进而用于疾病诊断目前主要涉及：癌症、心血管疾病、血液病、遗传性疾病、神经系统疾病、部分感染性疾病、免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤等。基因功能分析研究将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。药物筛选在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（highthroughoutscreening），可使新药开发获得技术上的突破。EvanseandRellingScience,286(5439):487,Oct15,1999•BCC研究公司发表的生物芯片市场调查报告称，2007年，全球生物芯片市场大约为19.379亿美元，2008年将达到21.156美元，2013年这一市场是38亿美元，年增长率高达12.7%。本章复习要点