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第八章植物基因工程基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。目的是改变植物性状，培育高产、优质highyield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。植物转基因研究的用途：1）理论研究：如基因功能分析；2）实践应用：如作物遗传改良。基因工程的基本内容1）目的基因的分离；2）目的基因与载体连接；3）重组分子转入寄主细胞并繁殖；4）阳性克隆的筛选；5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因；6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。植物基因工程的一般流程目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测→转基因植物的表型鉴定→转基因植物的遗传分析、田间试验经遗传改良的生物,统称：geneticallymodifiedorganism(GMO)；Geneticallyengineeredorganism(GEO)。转基因植物(transgenicplants),又称：geneticallymodifiedplant(GMP)；geneticallymodifiedcrop(GMC)。第一节目的基因的分离目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为~。可能是:1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区；2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）；3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。来自DNA分子中的外显子。4）一个完整的操纵子或基因簇；5）只含启动子或终止子等元件的DNA片段。1.分离目的基因的策略/方法：1)基于已知/同源序列——分子杂交/筛库与PCR；cDNA文库和基因组文库（1）构建基因组文库或cDNA文库；基因组文库：将生物基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体连接并导入宿主细胞，进行扩增。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，包含该生物所有的基因。cDNA文库(cDNAlibrary)：以某一组织、器官或处理材料中的mRNA为模板，逆转录成双链cDNA分子，插入载体形成重组分子，再导入宿主细胞进行扩增。这些在重组体内的cDNA的集合，即为cDNA文库，包含正在表达的基因。（2）用已知或同源序列标记探针、筛库。经典、较常用。筛库——菌落原位杂交如果所要获得的基因在其它植物上已经分离,序列已知,则可以采取以下两种方法分离研究植物上的相关基因:一是基因序列同源克隆法。根据发表的序列设计引物,以基因组DNA或mRNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库获得全长基因或用RACE得到全长基因。二是用作探针直接筛库。若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库,获得研究植物里的基因.（3）用PCR技术扩增目的基因gDNA-PCR;RT-PCRRACE-PCR；简捷、常用2)基于转录本表达差异DDRT-PCR：mRNA差异显示技术，DDRT-PCR:根据真核生物3′端poly(A)尾的特点设计锚定引物,这些引物组合扩增后约能得到大致包括某一发育阶段的全部基因,扩增后利用测序胶分离,放射自显影或银染获得结果,并对差异片段回收、克隆、测序以确定其是否为目的基因。SSH：抑制性差减杂交，此技术是以抑制PCR和杂交二级动力学为基础的DNA扣除杂交方法。含有目的基因的样品称为检测方,不含有目的基因的样品称为驱动方。3)基于人工突变体—T-DNA标签法与转座子标签法；适用于模式植物T-DNA:根癌农杆菌Ti质粒中一段可转移DNA，插入基因引起突变。机制：T-DNA或转座子随机插入到基因组的某一位点,引起该位点基因功能改变,这个位点就被标记,再利用T-DNA或转座子序列探针对突变基因组文库进行筛选或设计引物扩增,就可以分离出标记位点的基因。4)基于分子标记连锁图谱—图位/定位克隆；——要求精细物理图谱等图位克隆：从一种基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因，又叫定位克隆。机制：根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座位,利用分子标记对目的基因进行精细定位,并用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库(包括YAC、BAC、TAC、PAC或Cosmid库),从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步查(chromosomewalking)逐步逼近目的基因或通过染色体着陆(chromosomelanding)的方法最终找到含有目的基因的克隆,再经过遗传转化证实目的基因的功能.图位克隆的技术环节（1）构建遗传作图群体用于作图群体的类型可有多种。（2）筛选与目标基因连锁的分子标记。（3）局部区域的精细定位、作图（4）构建高质量的基因组文库（5）染色体步行、登陆。（6）鉴定目标基因图位克隆的基本流程：（1）构建遗传图谱：目的基因初步定位→分子标记；（2）构建物理图谱：局部区域的精细作图，目的基因精细定位(kb/cM)；（3）构建基因组文库：BAC、YAC、Cosmid等；（4）染色体步行或登陆：获得候选克隆→探针；（5）筛选基因文库：获得目的克隆；（6）鉴定目的基因。5)其他方法—人工合成，适用于小基因、突变或修饰；基因表达谱(Macroarray/Microarray)分析:基因芯片/微矩阵第二节基因克隆的主要工具酶1.限制性核酸内切酶限制作用:指宿主细胞利用限制酶降解外源DNA，保护其遗传稳定的现象。修饰作用:指宿主细胞通过甲基化酶使自身DNA进行甲基化修饰,达到识别自身和外来DNA、使自身DNA免遭限制酶降解的现象两种末端——粘性末端：酶切位点在两条DNA单链上反向互补，产生的两个末端碱基互补配对，易连接。平齐末端：酶切位点在两条DNA单链上相同，形成平齐末端，较难连接。限制酶：一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割双链DNA分子的核酸水解酶，水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。2.DNA连接酶DNA连接酶：催化双链DNA切口（nick,而非裂口/缺口gap)处的5`-P和3`-OH生成磷酸二酯键，需能量。T4DNA连接酶:需ATP，制备容易，连接具有粘性末端或平末端的DNA分子，应用广泛。3.DNA聚合酶1)E.coliDNApolI：制备探针、缺口填充等。2)Klenow片段(E.coliDNApolI经蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段):补平粘端、DNA片段末端标记、cDNA第二链的合成等。3)逆转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，合成cDNA链。AMV和MLV。4)耐热DNA聚合酶：TaqDNA酶、PfuDNA聚合酶等。第三节受体细胞/系统定义：外源DNA导入、扩增、表达的细胞。对受体菌的要求:１）易于转化或转导：感受态；２）限制-修饰系统缺陷型；３）重组系统缺陷型：recA、recB等失活；４）有明显的选择性差异，便于重组子筛选；５）载体复制、扩增不受阻；６）感染寄生缺陷型。常用EcoliK12派生株系。第四节植物转化/表达载体1.载体（vector）:将外源DNA携带进入宿主细胞的工具，本质是DNA。载体的基本构件：1）自主复制元件，或能整合在宿主基因组进行复制；2）多克隆位点（MCS）:插入外源DNA；3）选择标记：如抗性基因，筛选重组子；4）基因表达元件：启动子、终止子。基因工程中所用的载体按功能分：1）克隆载体：外源基因的保持与扩增；2）表达载体：外源基因的表达（转录与翻译）。2.植物转化载体的种类与特点2.1植物病毒载体类型：单链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒。构建策略：通过置换或插入等方法，去除基因组中的致病基因或不重要区域，插入外源基因。由CaMV(花椰菜花叶病毒)、TGMV(番茄金色花叶病毒）、BMV(雀麦花叶病毒）、CPMV(豇豆花叶病毒）构建的载体已得到转化植株或细胞。病毒载体的优点：1）能将外源基因直接导入完整植株，并系统地分布到整株，免去组培再生操作；2）不受单、双子叶寄主的限制；3）外源基因随病毒基因组快速、大量复制，易得到基因表达产物；4）一般不整合到植物基因组，不影响植物基因表达。病毒载体的缺点：1）外源基因不能整合到植物基因组，瞬时表达，故不能稳定遗传；2）存在致病的可能性；3）由于病毒的高变异性，使外源基因exogenous易于丢失。病毒载体的应用：1)基因功能研究：主要领域，瞬时表达。病毒诱导的基因沉默（virus-inducedgenesilence，VIGS）技术：近几年发展，用携带目标基因的病毒载体侵染植物，诱导相关基因沉默，根据表型推断目标基因的功能。2)生产疫苗等医用蛋白。2.2农杆菌质粒载体农杆菌：土壤杆菌，G-，主要侵染双子叶，致瘤。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)：诱发产生冠瘿瘤，致瘤性来自Ti质粒。发根农杆菌(A.rhizogenes):诱发产生毛根症，病症来自Ri质粒经改造后的Ti和Ri质粒是植物转化的理想载体。2.2.1根癌农杆菌Ti质粒Ti质粒：1974年分离,160-240kb,大型环状双链DNA分子。其与植物DNA结合的部分（称为T－DNA）T-DNA：1977年证明，是Ti质粒上一段可转移到植物细胞并整合在染色体上的DNA，载有诱导冠瘿瘤的基因。Ti质粒的类型根据所合成的冠瘿碱种类，分4类：1）章鱼碱型(octopinetype)；2）胭脂碱型(nopalinetype)；3）农杆碱型；4）农杆菌素碱型/琥珀碱型。冠瘿碱：氨基酸类似物，农杆菌的碳源和氮源。Ti质粒的结构与功能Ti质粒的分区：1)T-DNA区T-DNA：转移到植物细胞并整合在植物核基因组的一段DNA，通常23kb(12-24kb)，载有致瘤基因和冠瘿碱合成酶基因，以及左、右边界重复序列LB和RB。功能：转移到植物细胞，致瘤基因产物可使侵染部位产生冠瘿瘤。2)Vir区Vir区：毒性区，35～40kb,含7个基因/操纵子。功能：接受植物创伤信号分子，启动Vir基因表达，协同其他因子完成T-DNA解旋、单链切割、加工及转移等过程，使农杆菌表现毒性。3)Ori区复制起始区，调控质粒自我复制。4)Con区接合转移编码区，编码与接合转移有关的基因（tra）。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移。5)冠瘿碱代谢区分解利用冠瘿碱作为自己的碳源和氮源。2.2.2发根农杆菌Ri质粒Ri质粒：200~800kb，与Ti质粒结构相似。根据冠瘿碱的种类,可将Ri质粒分为三类①甘露碱型,合成甘露碱、甘露碱酸、农杆碱酸和农杆碱素,②黄瓜碱型,合成黄瓜碱③农杆碱型,合成农杆碱、农杆碱酸、甘露碱、甘露碱酸和农杆碱素。Ri质粒的优点：1）诱导的不定根可分化成完整再生植株，载体可不解除武装（onc+载体）；2）每条发状根是一个单细胞克隆，可避免嵌合体；3）发状根适于离体培养，而且具有原植株的次生代谢物合成能力，可用于次生代谢物生产。3.野生型Ti质粒的转移与致瘤性3.1T-DNA的结构与功能T-DNA：含2类基因：1）致瘤基因:tms和tmr，即生长素与细胞分裂素合成基因，可致瘤；2）冠瘿碱合成酶基因:tmt，冠瘿碱是农杆菌生长的碳源和氮源。有2个保守序列：LB和RB：即左边界和右边界，25bp正向重复序列，缺失RB则不能转移。章鱼碱型与胭脂碱型T-DNA的差别胭脂碱型：T-DNA是连续的片段，编码13个基因；章鱼碱型：T-DNA由2个分离的片段组成，左区（TL-DNA）14kb,有8个基因，右区（TR-DNA）7kb,有5个基因；LB右边约17bp处有一个24bp的超驱动序列OD，促进T链形成，起转移增强子作用。3.2Vir区基因的结构与