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第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9专题内容基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术,可以精确地定位到基因组的某一位点,并剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段基因编辑技术基因编辑工具锌指核酸内切酶（ZFN）类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）成簇、规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9（CRISPR/Cas9）基因编辑工具ZFNTALENCRISPR/CasTargetProtein:DNAProtein:DNA(gRNA-Cas9):DNAStructureZincfingerDNAbindingmotifsinaββαconfiguration,theα-helixrecognizes3bpsegmentsinDNAProteinscontainingDNA-bindingdomainsthatrecognizespecificDNAsequencesdowntothebasepair20ntcrRNA(CRISPRRNA)fusedtoatracrRNAandCas9endonucleasethatrecognizespecificsequencestothebasepairFeasibilityDifficult:-Needacustomizedproteinforeachgenesequence-LowdeliveryefficiencyEasy:-all-in-onegRNA-Cas9vectorsystem-multigeneeditingisfeasibleReferenceBeerlietal.,1998Perez-Pineraetal.,2012Gajetal.,2013MoscouandBogdanove,2009Bochetal.,2009Gajetal.,2013Malietal.,2013Congetal.,2013Jiangetal.,20151987IshinoY等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列2005三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源2002该结构被正式定义为成簇、规律间隔短回文重复序列（CRISPR）2007Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抗噬菌体入侵。2013Zhang研究组首次在人293T细胞与小鼠Nero2A细胞中利用Crispr/Cas9系统实现了基因定点突变。Crispr/Cas9研究历史II型CRISPR免疫II型CRISPR免疫Crispr/Cas9系统核心：Cas9核酸酶、sgRNACRISPR系统结构(间隔相邻基序)Cas9切割后的DNA修复编辑效率检测T7E1AssayssgRNA设计功能物种数最大输入长度（nt）网址CRISPRDesign设计/脱靶效应评估1523-500设计/脱靶效应评估9不限设计/脱靶效应评估10不限设计/脱靶效应评估33不限设计/脱靶效应评估3323-5000设计/脱靶效应评估23不限设计/脱靶效应评估28不限基因编辑流程T7E1Crispr系统应用GeneticDiseasesCancerCardiovascularDiseaseHIVViralDiseasesImmunodeficiencyCrispr系统应用WenhuiHu,etal.PNAS.2014,111(31):11461-6CRISPR/Cas9基因编辑技术能够有效利用其sgRNAs靶向作用于HIV-1原病毒LTR(长末端重复序列)区，对HIV-1原病毒进行有效清除。在感染HIV-1的细胞中使用携带2个sgRNAsCRISPR/Cas9系统可以明显抑制病毒复制与再生效率。Crispr系统应用ChenSD,etal.Cell.2015March12;160(6):1246–12602015年，ZhangF与PhillipA.Sharp团队构建了一个包含67405个sgRNA的CRISPR文库，作用于一个不具有转移能力的肺癌细胞系。将处理后的细胞接种于免疫缺陷小鼠后，小鼠出现了明显的肿瘤转移表型。建立癌症模型Crispr系统应用体外培养的人类正常肠道成体干细胞中通过CRISPR/Cas引入4个结肠癌基因突变(APC、P53、KRAS和SMAD4),建立结直肠癌类器官模型MatanoM,etal.NatMed,2015,21(3):256–262.2015年，Brandon等将CRISPR技术应用到了癌症相关的基因治疗研究，采用了慢病毒载体使CRISPR系统可以被Doxycycline诱导表达，对细胞进行编辑，实现抗凋亡基因MCL-1在体内体外的敲除。BrandonJ,etal.CellRep,2015,10(8):1422–1432.Crispr系统应用Crispr系统应用程序性死亡受体Programmeddeath-1(PD-1)主流治疗手段：抑制性单克隆抗体药物临床实验Sponsor&CollaboratorFirstreceivedPhaseBiologicalInterventionMetastaticNon-smallCellLungCancerSichuanUniversity&MedGenCell,Co.,Ltd.May30,2016PhaseIPD-1KnockoutTCellsCastrationResistantProstateCancerPekingUniversity&CellBiotechCo.,Ltd.August11,2016PhaseIPD-1KnockoutTCellsMuscle-invasiveBladderCancerPekingUniversity&CellBiotechCo.,Ltd.August1,2016PhaseIPD-1KnockoutTCellsMetastaticRenalCellCarcinomaPekingUniversity&CellBiotechCo.,Ltd.August11,2016PhaseIPD-1KnockoutTCells新型疗法嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）不良反应：细胞因子释放综合征基因编辑技术应用在CAR-T上的成功案例：Cellectis公司UCART19新型疗法UCART19+TALENTCRαCD52RQR8降低排异反应使细胞对阿仑单抗耐药，用于CAR-T细胞筛选，提高筛选效率和疗效可增加细胞对利妥昔单抗的敏感性降低副作用率，保证安全性CRISPR/Cas9CAR-T2.0VerCAR-T&&新型疗法发展机会：1.具备CRISPR技术储备2.临床研究经验丰富3.靶点储备丰富4.免疫细胞储备Thanks！2016.8.27