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第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）:在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/inductionstage,Inductionofgrowth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。持续十几小时~几天。2）分裂期（divitionstage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。3）形成期（formationstage/Differentiationphase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。2.愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。3.影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。方法：一般每3~4周继代1次；每次取生长迅速、浅色、疏松的愈伤进行；继代用培养基与原来相同，或根据培养目标、培养阶段不同而改变成分，通常是改变激素配比。注：通过调节培养基成分，特别是生长调节剂种类和比例，可使不同类型愈伤在一定程度上相互转变。紧实提高生长调节剂浓度减少或除去生长调节剂松脆紧实提高生长调节剂浓度减少或除去生长调节剂松脆继代培养的目的：获得大量优良愈伤，供进一步研究之用。优良愈伤的特点：1）疏松易碎和旺盛的增殖能力，以便建立悬浮系或无性系；2）经长期继代仍保持较强的再分化能力，便于获得再生植株或进行遗传操作。三、悬浮培养悬浮培养（suspensionculture）：将疏松易碎、生长旺盛的愈伤小块放入液体培养基中进行振荡培养，以形成分散性好的游离单细胞和小细胞团的培养技术。小型培养用100~250ml三角瓶；大规模培养用特制的培养容器进行。1.悬浮培养的用途1）提供一个相对一致的细胞群体，供生理生化、胚胎发生、基因表达等研究。2）次生代谢物质生产。3）细胞突变体的诱变与筛选。4）分离原生质体。理想的悬浮系：应由大量增殖迅速的游离细胞组成，但一般的悬浮系是由单个细胞与大大小小的细胞团块组成的混合物。2.影响悬浮培养的因素1）培养基成分：一般，适于培养松脆愈伤的培养基也适于建立悬浮系。生长调节剂：通常生长素较多分散性好，如甘薯茎尖，MS+2mg/L2,4-D。无机磷：适当增加。葡萄糖：作碳源效果较好。2）细胞密度：接种足够的细胞块，过滤去掉大块。3）振荡速度：30~150rpm，使愈伤破碎、均匀分布，促进气体交换。4）继代时间：一般7~15d一次。3.悬浮培养物的继代与测定1）继代培养：小型培养：将培养瓶静置，吸去上清，加入新鲜培养液；或者吸取悬浮液，转接到含新鲜培养液的培养瓶。大规模培养：在培养容器中不断注入新鲜培养液，排出旧培养液，保持体积恒定和营养物的补充。2）细胞增殖的测定：A.细胞鲜、干重：尼龙丝网收集细胞，经真空抽滤称鲜重，经60~80℃烘干称干重。B.细胞密实/叠积体积：将已知体积的悬浮液转入刻度离心管中，低速离心，用每毫升培养液中细胞的毫升数表示。C.细胞数：血球计数板或特制的计数盘。注意：1）长期继代培养会发生体细胞无性系变异（somaclonalvariation）：染色体数目、结构变异，或基因突变，不利于保持供体植物的遗传稳定性，并使再生力下降甚至丧失，但有利于育种和遗传研究，是重要育种方法，如从马铃薯育成抗早疫病品种，从水稻育成抗白叶枯病品种等。2）长期继代培养会造成试管苗玻璃化加重。因此，要及时进行分化培养。第二节愈伤组织分化和植物再生一、器官发生与植株再生器官发生（organogenesis）：指培养物在适宜条件下产生不定芽（adventitiousbud）和不定根（adventitiousroot），然后形成完整植株的过程。又称器官建成/形成/不定器官形成。常见再生途径。1.器官发生的方式/途径1）直接发生：从外植体中已存在的器官原基（茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎）直接形成相应的器官，或者从外植体脱分化形成的分生细胞团上直接形成器官原基。2）间接发生：由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤分化成器官原基并发育成器官(常见方式)。2.器官发生的顺序1）先芽后根：在同一培养基上从芽的基部分化出根，或将芽移入生根培养基而生根(常见)。2）先根后芽：较难诱导生芽，尤其单子叶植物。3）在愈伤不同部位分别形成根或芽，再通过维管组织联系而形成完整植株。4）仅形成芽或根。芽是外起源，即由愈伤外层细胞形成芽原基;根是内起源，即根原基发生于组织深处。3.器官发生的生理与分子基础（了解）器官发生时有特异蛋白产生，同功酶谱变化；淀粉积累是芽和根分化的先决条件，供能，随着进一步发育而消失；一些氨基酸、多胺和内源激素水平也有变化。拟南芥等，在不定根和不定芽发生时都有特异基因表达。外源和内源激素可能通过调节基因表达而调节器官发生。二、体细胞胚胎发生与植株再生合子胚（zygoticembryo）：植物通过自然受精作用而形成的受精卵/合子，经历原胚proembryo、球形胚globalembryo、心形胚heart-stageembryo、鱼雷形胚torpedo-stageembryo和子叶形胚cotyledon-stageembryo发育而成的胚。体细胞胚胎发生（somaticembryogenesis）：指体细胞培养物在适宜培养条件下形成类似于合子胚的结构，进而发育成完整植株的过程。反足细胞极核助细胞卵细胞子叶胚芽胚柄胚根合子原胚顶细胞基细胞球形期心形期鱼雷形期子叶期不等分裂反足细胞极核助细胞卵细胞子叶胚芽胚柄胚根合子原胚顶细胞基细胞球形期心形期鱼雷形期子叶期不等分裂它的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。胚状体（embryoid）:经体胚发生形成的类似于合子胚的结构称为体细胞胚或胚状体，或不定胚。花粉胚pollenembryoid：由小孢子或者其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，发育成单倍体植株。2.体胚与合子胚的比较1)胚胎发生和发育过程相似，形成具有胚芽、胚根,、胚轴的胚状结构，进而形成完整植株。2)无胚乳endosperm或胚乳/子叶发育不良；3)无种皮；物质积累少；4)质量差，萌发率低；5)一般体胚的干燥和休眠过程短暂或缺乏。体胚再生途径的优点：1）数量多、速度快、成苗率高；2）可制成人工种子，便于运输和保存；3）再生过程简单，遗传性稳定。4）多数认为体胚起源于单细胞，转基因植株嵌合体少，遗传稳定。胚性愈伤/细胞（embryogeniccallus/cell）：能够形成胚状体的愈伤或细胞。3.体胚发生的生理与分子基础（了解）胚性与非胚性细胞在蛋白、同功酶电泳谱带上存在差异；拟南芥合子胚发育的必需基因有500~1000个，已发现影响体胚发生的基因有近40个，其中一些基因在胚胎发生中表达增强（如钙信号转导基因），另一些则为发育阶段或组织特异性表达，如体胚发生的受体激酶基因SERK只在胚胎发生的早期表达。4.胚状体与不定芽的区别及其优点1）在外观上，体胚和不定芽均有光滑、圆形的突起，早期区别难。2）组织学区别：（1）胚状体有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。（2）胚状体有生理隔离：其维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往与愈伤或外植体的维管组织相连。（3）胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽无此现象。单细胞培养胚状体的突破有重要意义：1、可给植物基因工程提供最有效的受体材料；2、可有效服务于物种改良及稀有物种的种质资源保藏。三、影响植株再生的因素1.外植体基因型：烟草、胡萝卜和矮牵年等易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等比较困难；柑橘类、胡萝卜、矮牵牛等较易诱导体胚，而烟草较难。来源或生理状态：如油菜的花器官、水稻和小麦的幼穗比叶、根等易于分化成苗；幼嫩组织（如子叶）比老组织易于发生体胚。2.培养基成分1）激素：常用较高细胞分裂素/生长素促进生芽，但有时绝对浓度更重要；将二者配合使用常利于诱导体胚。培养物的内源激素水平使问题复杂化。2,4-D：诱导特异基因表达，进而诱导胚性细胞形成，但在体胚发育中需降低或去除。ABA：促进某些植物体胚发育。细胞分裂素：对体胚诱导作用不显，但可显著促进体胚成熟，特别利于子叶发育。乙烯和GA：常抑制体胚发生。2）其他成分增加无机磷可促进茄科Solanaceae植物的器官分化；减少矿质元素可提高大多数植物生根（1/2MS或White）；较高浓度蔗糖利于禾本科器官形成；K+和铁盐为体胚诱导所必需;高浓度Ca2+抑制体胚发生；NH4+利于体胚发生。3.培养条件1）光照一般14~16h光照、8~10h黑暗；近紫外和蓝紫光促进生芽，而红光促进生根；光照一般促进体胚发生。2）温度接近于植物原产地的温度利于再生。经验之谈，应根据实验确定。第三节试管苗的移栽一、试管苗与自然苗的区别1.试管苗角质层/蜡质层薄弱，易失水；2.试管苗生长势弱，适应性差；3.试管苗根系弱、功能差。二、试管苗移栽的注意事项1.要炼苗（domestication）移前加强光照，开瓶塞，使适应外境。约需1周。2.选择合适的移栽介质先移入人工调配的混合营养土（腐殖土、泥炭土、蛭石等），最好灭菌。3.移栽时洗净琼脂，防止污染。4.防止伤根。5.加强栽后管理用喷雾、搭棚等保湿，但土壤湿度不能过高；遮强光；温度逐渐接近室外。