第三章分子荧光光.

第三章分子荧光光谱法第一节概述一、荧光的发现第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，他于1575年提到，在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色。以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概念，并提出了“荧光”这一术语，他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现象。可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。1867年，Goppelsröde应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作。进入二十世纪以来，荧光现象被研究得更多了，在理论和实验技术上都得到极大的发展。特别是近几十年来，在其他学科迅速发展的影响下，随着激光、计算机和电子学的新成就等一些新的科学及技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术上的发展，出现了许多新的理论和新的方法。在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作者从事荧光分析方面的研究工作。到了七十年代以后，已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍。目前，研究内容已从经典的荧光分析方法扩展到新近发展起来的一些新方法和新技术。磷光也是某些物质在紫外光照射下所发射的光，早期并没有与荧光明确的区分。1944年Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光，它有别于从激发单重态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也不断得到发展。二、光致发光在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。第二节基本原理一、荧光的产生（一）分子的激发每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0,M=1,该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。下图为电子重态示意图。（a）基态单重态（S0）（b）激发单重态（S）（c）激发三重态（T）能量激发单重态与激发三重态的区别1、激发单重态分子是抗磁性分子，而激发三重态分子则是顺磁性2、激发单重态的平均寿命大约为10-8s，而激发三重态的平均寿命长达10-4s3、电子由S0→S1、S2等的跃迁较容易，属于允许跃迁，而由S0→T1、T2等的跃迁很难发生，属于禁阻跃迁。4、激发三重态比相应的激发单重态能级稍低一些。处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量而返回基态。辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。振动弛豫(简写为VR)——当分子吸收光辐射(为图中的λ1、λ2)后可能从基态的最低振动能级(V=0)跃迁到激发单重态Sn(如图中S1、S2)的较高振动能级上。然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为10－12s数量级。内部转移(IC)——当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。如中，S2和T2中的低振动能级与S1和T1中的高振动能级重叠，电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1。这个过程称为内部转移。内部转移的时间为10－11s～10－13s数量级。振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。系间跨跃(ISC)——系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如图中S1的最低振动能级与T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。荧光发射(FE)——处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(V=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。由于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长，即。第一激发单重态最低振动能级的平均寿命约为10－9～10－4s，因此荧光寿命也在这一数量级。磷光发射(PE)——激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为10－4～100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即。必须指出的是T1还可能通过热激发而重新跃回S1即T1→S1，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即S1→S0，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。外部转移(EC)——激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭或熄灭。荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。1.激发光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法是，通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强度，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λex表示。二、激发光谱和发射光谱2.发射光谱，也称荧光光谱或磷光光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。其测绘方法是，固定激发光的波长，扫描发射光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λem表示。磷光发射波长比荧光来得长，图为萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱。萘的激发光谱、荧光和磷光光谱斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，λemλex。Stokes于1852年首次发现这种波长位移现象，故称Stokes位移。斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失。激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S1电子激发态的最低振动能级，这是产生其位移的主要原因；其次，荧光发射时，激发态的分子跃迁到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。荧光发射光谱的形状与激发波长无关由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。因此除了少数特殊情况，如S1与S2的能级间隔比一般分子大(如)及可能受溶液性质影响的物质外，荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。荧光激发光谱的形状与发射波长无关由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为量子产率)与激发光的波长无关，因此用不同发射波长绘制激发光谱时，激发光谱的形状不变，只是发射强度不同而已。荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同。然而实际并非如此，由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别。只有在校正仪器因素后，两者才非常近似，而如果也校正了环境因素后，两面的形状才相同。如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。如图分别表示苝的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液的吸收光谱和荧光发射光谱。三、影响荧光的因素（一）荧光效率荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强，荧光效率在0～1之间影响荧光效率的因素主要取决与分子的化学结构，同时也与外界环境有关（二）影响荧光的因素1、分子结构（1）跃迁类型实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由π→π*跃迁或n→π*跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生π*→n跃迁或π*→π跃迁而产生荧光。π→π*跃迁通常产生较强的荧光效率1、其中π→π*跃迁吸收时跃迁的摩尔吸光系数比n→π*跃迁的大102～103倍，（π→π*跃迁几率大，为允许跃迁），对激发光吸收较多，激发效率高2、π→π*跃迁的寿命(10－7～10－9)比n→π*跃迁的寿命(10－5～10－7)短，在各种去激发过程的竞争中，激发态寿命短，其他非荧光过程发生几率小，荧光效率高3、π→π*跃迁能级差比n→π*跃迁的大，体系间跨越的发生几率小，对荧光过程有利。（2）共轭效应发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。如苯、萘、蒽三者的共轭程度依次增大，其荧光效率分别为0.11、0.29、0.36.（三）刚性结构和共平面效应实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量外部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近，只是由于荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，在0.1mol·L-1的NaOH溶液中，荧光效率达0.92，而酚酞却没有荧光。又如芴与联二