第三章发酵工程原理及其在食品工业中的应用.

第三章发酵工程原理及其在食品工业中的应用第一节概述发酵：借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身，或其初级代谢产物、次级代谢产物的过程。发酵工程：也称微生物工程。利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下，通过现代化工程技术手段，最大限度地发挥微生物的某种特定功能，以生产出人类所需的产品。一、发酵工程的定义（一）发酵工程主要研究对象1.大规模微生物细胞培养过程；2.大规模培养基灭菌和空气灭菌过程；3.微生物细胞生长和产物形成动力学；4.发酵过程的优化；5.生物反应器的放大和设计；6.发酵过程的参数监控和计算机应用；7.发酵产品的分离和纯化等工程技术问题。（二）发酵工程产品类型1.以菌体为产品。(酵母菌、单细胞蛋白)2.以微生物的酶为产品。（碱性蛋白酶、淀粉酶）3.以微生物的代谢产物为产品。（氨基酸、脂类）4.利用发酵作用，对某种化合物的化学结构进行改造，即产品的转化过程。（醋的酿造）二、发酵工程的发展简史（一）天然发酵阶段主要产品有黄酒、白酒、啤酒、酒精和醋等。多数产品为厌氧发酵、非纯种培养、凭经验传授技术和产品质量不稳定是这个阶段的特点。（二）纯培养技术的建立纯培养技术的建立是发酵技术发展的第一个转折时期。（三）通气搅拌发酵技术的建立通气搅拌发酵技术的建立是发酵工业上的第二个转折点。（四）代谢控制发酵技术由氨基酸发酵而开始的代谢控制发酵，使发酵工业进入一个新的阶段。随后，核苷酸、酶制剂以及有机酸等方面也利用代谢调控技术进入发酵生产。（五）开拓发酵原料时期石油化工副产物石蜡、醋酸、甲醇以及甲烷等碳氢化合物被用来作为发酵原料。（六）基因工程阶段使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物，如胰岛素、干扰素、白介素和多细胞生长因子等，大大地拓宽了发酵工业的范围，使发酵工业发生了革命性变化。三、发酵工艺及方法（一）固体发酵法利用固体基质，如麸皮、米糠、秸秆等为主要原料，再根据需要添加其他谷糠、豆饼、无机盐等，加水拌成含水量适度的半固态物料作为培养基，供微生物的生长繁殖和产生代谢产物。目前利用固体发酵法生产的产品有酒曲、白酒、酱油、食醋、腐乳、酶制剂、食用菌等。（二）液体发酵法利用液态培养基，进行微生物的生长繁殖和形成人们所需要的代谢产物。根据通气（供氧）或不通气及通气方法的不同，又分为液体表面发酵法、液体深层通气发酵法、液体厌氧发酵法三种。固体发酵与液体（深层）发酵相比，具有以下优点1.固体发酵单位体积的酶产量往往高于液体发酵几倍，甚至几十倍，特别适合真菌酶类和一些次级代谢产物及大型真菌的生产。2.操作简单，适应性强，原料来源广，价格低廉，可以利用多种其他发酵工艺无法利用的粮食加工下脚料或废料进行生产。3.固体发酵仅需空气自然对流或小量通风即可，能耗低。4.固体发酵的产物提取一般步骤少，降低生产成本。有些产物，如饲料或饲料添加剂，不需要分离步骤，全部发酵物质可以作为产品。5.发酵工艺全过程无废水或很少，可以减少环境污染。1.液体表面发酵法又称液体浅盘发酵法或静置培养法，是将已灭菌的液体培养基，接入微生物菌种后，装入可密闭的发酵箱内盘架上的浅盘中，薄薄一层，液层厚约1～2cm，然后向盘架间通入无菌空气，通过浅盘内培养基的表面供给氧气，并维持一定的温度进行发酵。优点：无须搅拌，动力消耗省。缺点：控制杂菌污染较难，所需场地较大，劳动强度大，生产效率低。2.液体深层通气发酵法将微生物接入装有无菌液体培养基的封闭发酵罐中进行培养或发酵的技术。优点：①容易按照生产菌种对代谢营养物以及不同生理时期的通风、搅拌、温度和培养基pH值等的要求，选择最佳培养条件。②产品纯度高，质量也较稳定，还具有机械化程度高、劳动强度小、设备利用率高等优点。缺点：易染菌、无菌操作要求高、设备投资大。3.液体厌氧发酵法能作大规模液体培养的厌氧菌仅丙酮丁醇梭菌，用于丙酮的发酵生产。酒精、啤酒、葡萄酒、酸乳的发酵属于兼性厌氧发酵，菌种培养时需要适量通气，发酵时则不通气。优点：可省略通气和搅拌设备，简化工艺过程，还能大大节约能源的消耗，提高生产效率。四、我国发酵工业与先进国家相比，存在的主要差距1.传统发酵产品及产量发展过大过快酒类、谷氨酸、柠檬酸、普通酶制剂和抗生素等。2.发酵产品工业产值在国民生产总值中的比例较低（1%）以下3.发酵产品档次低，品种少，不配套。4.技术创新力度不够，低水平重复现象严重。1.菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和繁殖，并且生成所需的代谢产物产量要高。2.菌种可以在要求不高，易于控制的培养条件下（糖浓度、温度、pH值、溶解氧和渗透压等）迅速生长和发酵。3.菌株生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。第二节食品发酵菌种筛选一、食品发酵工业对微生物菌种的一般要求4.根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。5.选择一些不易被噬菌体感染的菌株。6.生产菌种纯度高，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。7.菌体不能是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质（包括激素和毒素等），以保证安全。二、食品发酵工业常用微生物（一）细菌发酵工业中常用的细菌：枯草芽孢杆菌（蛋白酶、淀粉酶）、乳酸杆菌（乳酸）、醋酸杆菌（醋酸）、梭状芽孢杆菌（丙酮、丁醇）、巨大芽孢杆菌（葡萄糖异构酶）、大肠杆菌（谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶等）、产氨短杆菌（氨基酸、核苷酸）等。（二）酵母菌发酵工业中常用的酵母：酿酒酵母、汉逊酵母和各种假丝酵母等。除了用来酿造饮料酒、酒精和烤制面包外，还可用于生产甘油、酶制剂、有机酸等。此外，由于酵母菌体本事富含蛋白质、核糖核酸、细胞色素C、酶类及多种维生素，又是医药、食品、饲料行业中的重要原料。（三）霉菌发酵工业中常用的霉菌：根霉属，主要产淀粉酶、脂肪酶、乳酸、甾体激素等；毛霉属，主要产蛋白酶、凝乳酶、草酸、甾体激素等；木霉属，主要产纤维素酶等；青霉属，主要产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、维生素等；曲霉属，主要产维生素C、柠檬酸、各种水解酶类等。（四）担子菌担子菌的多糖物质具有很强的生理活性，尤其是提高机体免疫力、抗肿瘤作用等方面越来越引起人们重视。此外，担子菌通过液体发酵得到的菌丝体富含蛋白质、多糖、维生素等，可用于食品、医药和保健行业。（五）藻类自然界分布极广的一大群自养微生物资源，许多国家已把它用作人类保健食品和饲料。三、生产菌种选育（一）自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。（二）诱变育种利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞遗传物质的分子结构发生改变，从而引起菌体发生遗传性变异，再用合理的筛选方法从细胞群体中筛选出少数具有优良性状的菌株。（三）杂交育种（原生质体融合）指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。（四）分子育种应用基因工程方法进行的育种。四、生产中常用菌种的保藏（一）生产中菌种来源自然界分离筛选；菌种保藏机构获得；已有菌株中筛选突变株。（二）菌种保藏原理根据微生物生理、生化特点人工创造条件，使微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥和缺氧三者，在此种条件下，使菌株很少发生突变，以达到保持纯种的目的。（三）菌种保藏方法1.冷冻保藏普通冷冻保藏技术（－5～－20℃）、超低温冷冻保藏技术（－60～－80℃）和液氮（－196℃）冷冻保藏技术2.冻干保藏3.传代保藏将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定温度下生长和保存的传代保藏方法。4.矿物油中浸没保藏将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏。5.干燥－载体保藏干孢子形成真菌和链霉菌时可通过吸附于干燥惰性固相载体如白土、硅胶或陶瓷表面获得较长时间的保藏。（四）菌种保藏注意事项1.菌种在保藏前所处的状态一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。2.菌种保藏所用的基质斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些。3.操作过程对细胞结构的损害（五）国内重要保藏菌种机构1.普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌、细菌中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AS-IV）：病毒2.农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）3.工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业研究所，北京（IFFI）4.兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品监察所，北京（CIVBP）5.医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）：真菌卫生部药品生物制品检定所，北京（NICPBP）：细菌中国医学科学院病毒研究所，北京（IV）：病毒6.抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学院抗菌素研究所，北京（IA）四川抗菌素工业研究所，成都（SIA）：新抗菌素菌种华北制药厂抗菌素研究所，石家庄（IANP）：生产用抗菌素菌种第三节培养基的组成及制备培养基：人工配制的供微生物或动、植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需要的产物的营养物质和原料。（一）按培养基的成分分类合成培养基：原料的化学成分明确、稳定，适用于研究菌种基本代谢的物质变化。但是生产某些疫苗等生物制品的过程中，为了防止杂蛋白等其他杂质混入，也常用合成培养基。合成培养基的营养成分单一且价格昂贵，故不适用于大规模生产。一、培养基的类型天然培养基：原料是一些天然的动植物产品，相对于合成培养基来说，其成分比较复杂，如玉米粉、花生粉、豆饼粉等。优点：营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。一般天然培养基中不需要另加微量元素、维生素等物质，且培养基组成的原料来源丰富、价格低廉，适合于工业生产。缺点：由于天然培养基的组分复杂，不同产地、不同季节、不同品种的相同原料，各种成分含量有所不同，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。（二）按培养基外观的物理状态分类固体培养基：主要成分为麸皮、大米、小米、稻糠和琼脂等，有的还含有一些其他营养成分。比较适用于菌种的分离和保存，也广泛应用于曲霉菌和有子实体的真菌类，如香菇、木耳、灵芝等的生产。半固体培养基：在配好的液体培养基中加入琼脂，一般用量为0.5%～0.8%，培养基呈半固体状态。主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等。液体培养基：80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分。流动好，输送方便，有利于氧气、其他物质和热量的传递，便于发酵参数的控制，是摇瓶发酵和大规模工业发酵最常用的培养基。（三）按用途分类斜面培养基：供菌种繁殖的一种常用的固体培养基。这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，并不易引起菌种发生变异。种子培养基：供微生物大量生长，为发酵提供活力强的种子。配制原则：使种子生长旺盛，各种有关的初级代谢酶的活力高，有利于接入发酵培养基后大量、快速合成产物。种子培养基一般要求有机氮源和维生素的比例较高。发酵培养基：供菌种生长、繁殖，得到所需要的目标产物。既要使种子接种后能迅速生长达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需的产物。发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的碳源、氮源、磷源等外，还要有产物合成所需的某些特定元素、前体和促进剂等。孢子培养基：主要用于制备微生物孢子。要求此种培养基能形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。繁殖和保藏培养基：主要用于菌种保藏，一般根据微生物的种类和营养要求加以选择。选择培养基：根据某（种）类微生物的特殊营养要求或对某种化学、物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样品中劣势菌变成优势菌，从而提高该（种）类的筛选效率。二、培养基的配制原则（一）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基不同的微生物所需营养物质不同，其培养基配方也不同。必须了解不同生产菌种的培养条件、代谢途径、代谢产物的化学性质，从而确定最优的培养基。（二）合适的碳氮比氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产