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1第十一章抗生素发酵生产工艺主讲教师：生科院洪军21.制药微生物生产菌种如何选育？发酵过程中主要检测的参数有哪些？2.发酵工艺过程如何控制？知识回顾3主要内容抗生素的概述：（1）抗生素的定义（2）抗生素的命名（3）抗生素的分类青霉素的发酵生产工艺：（重点）（1）青霉素的概述（2）生产菌的生物学特性（3）发酵工艺过程41抗生素的定义和命名（1）抗生素的定义早期：一般认为来源于微生物，且主要作用于细菌感染。故认为抗生素(antibiotics)是微生物在代谢过程中产的，在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活动，甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力，我们曾经把这类物质叫做抗菌素。5现在：来源：随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生素的来源正在扩大。可以是微生物、植物（如蒜素、常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等）、动物（如鱼素、红血球素等）。但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。作用对象：病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为抗菌药物。6定义：虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。目前，一个大多数专家所接受的定义是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和动物在内）在其生命活动过程中产生的或（化学合成获得的），能在低浓度下有选择地抑制他种生物机能的低分子量的有机物质。狭义的定义是：抗生素是低分子量的微生物代谢产物，能在很低的浓度下抑制其他微生物的生长。7按生物的来源：凡是在动、植物或微生物产生的，可按来源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素按化学结构命名：化学结构性质清楚的，如四环素（含有四并苯的基本母核），氯四环素（金霉素），氧四环素（土霉素）。名称R1R2微生物来源四环素HH金色链霉菌金霉素HOH金色链霉菌土霉素ClH龟裂链霉菌其它：纪念意义、产地、俗名如正定霉素、井冈霉素、金霉素和土霉素等。（2）抗生素的命名（一般分为三类）8HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-内酰胺环RnaturalpenicillinR=CH2-CO-9β-内酰胺环苯甲异噁唑青霉素氨苄青霉素羧苄青霉素苯氧甲基青霉素102抗生素的发展简史2.1治疗和发展我国的发展：1953年5月1日，建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂（上海第三制药厂）；1958年6月3日，最大的抗生素联合企业建成投产（华北制药厂,石家庄），也是青霉素发酵总容积居世界首位。目前，多为原料药基地。但在半合成及成品药的剂型方面与国外相比差距很大。11抗生素滥用的重灾区中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国：年产抗生素原料大约21万吨，出口3万吨，其余自用（包括医疗与农业使用)，人均年消费量138克左右(美国仅13克)。2011年4月7日是世界卫生日，首届合理用药大会在这一天召开，恰好契合了世界卫生日的主题——“抵御耐药性：今天不采取行动，明天就无药可用”。12“后抗生素时代”如果不再控制抗生素的滥用状态，二十一世纪人类有可能失去抗生素这个有利的治疗武器，重新回到没有抗生素的时代，所谓“后抗生素时代”。后抗生素时代是倒退，我们可能回到没有药物可使用的状态，大量的传染性疾病将危害人类的身体健康和生命。虽然这是一种悲观的想法，但悲观的很有道理，细菌产生耐药速度比新药物开发的速度快得多，这是一个确实的现象。133抗生素的分类可根据生物来源、作用对象、化学结构、作用机制、生物合成途径等方面对抗生素进行分类。3.1根据抗生素的生物来源分类(生物学家)（1）放线菌产生的抗生素：如链霉素、四环类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素）、放线菌素类（如放线菌素D）等。（其中链霉菌属最多，诺卡氏菌属、小单孢菌次之）（2）真菌产生的抗生素：如青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、头孢菌素）。14（3）细菌产生的抗生素：如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。如多粘菌素。（4）植物或动物产生的抗生素：从被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。3.2根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家）（1）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G-（2）抗G+的抗生素：如青霉素，（3）抗G-的抗生素：如链霉素（3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素（4）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒有一定作用。（5）抗癌的抗生素：如阿霉素153.3根据抗生素的化学结构分类（化学家）较复杂，目前已确定结构的抗生素习惯如下分类：（1）β-内酰胺类抗生素：包括青霉素类，头孢菌素类等（2）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等（3）大环内脂类抗生素：如红霉素、麦迪加霉素（4）四环类抗生素：如四环素、土霉素（5）多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽（6）蒽环类抗生素：如阿霉素、柔红霉素（7）喹诺酮类抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星163.4根据作用机制分类此种分类的优点：便于进行理论研究，有助于了解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出治疗的规律，使抗生素的使用更为合理。（1）抑制细胞壁合成的抗生素：如青霉素。（2）影响细胞膜功能的抗生素：多烯类抗生素。（3）抑制病原菌蛋白质合成的抗生素：四环素。（4）抑制核酸合成的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。（5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素。17183.5根据抗生素的合成途径分类（1）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头孢菌素等寡肽抗生素。（2）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。（3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素等丙酸衍生物。19生产方法：1、生物合成法：①传统方法②“工程菌”制造法③细胞融合技术法2、化学合成法；3、生物合成加化学合成法。4抗生素的生产工艺201、生物合成法：①传统方法大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。21②“工程菌”制造法第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麦迪紫红素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌”生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。22③细胞融合技术法对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高140倍。目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世。232、化学合成法根据某种抗生素的化学组成和结构，通过化学合成的方法，可生产部分抗生素。如：氯霉素、磷霉素等。经过化学合成方法和控制条件的不断深入研究，越来越多的抗生素可用化学合成法生产。243、生物合成加化学合成法许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死。现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。25抗生素制备的一般流程图菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处理及种子加滤提取及精制成品检验前体发酵阶段提取阶段成品包装5青霉素概述2627青霉素的理化性质青霉素本身为一元酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有机溶剂。游离酸或盐类的水溶液均不稳定，极易失去抗菌效力。不耐热，一般保存于冰箱中，但青霉素盐的结晶纯品，在干燥条件下可于室温保存数年。青霉素的抗菌效力与其分子中的β-内酰胺环有关。28抗菌作用和临床应用青霉素主要抑制G+菌，但对某些G-菌，螺旋体及放线菌也有强大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。29菌种：产黄青霉生长发育分七个阶段：Ⅰ—Ⅳ期：菌丝生长期，适宜做种子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期：菌丝体自溶期。5.1青霉素生产菌的特性点青霉30青霉素产生菌的生长过程分生孢子发芽期菌丝繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒减少，小空孢大空孢自溶菌丝生长期青霉素分泌期菌丝自溶期第1期：分生孢子萌发，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。发酵培养下的生长过程及细胞学变化镜检控制规定时间取样，显微镜观察7个时期的态变化，控制发酵。1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜种子。4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。第6期到来之前结束发酵。带放补料工6.1青霉素生产流程结晶器种子罐1和2米孢子预处理罐过滤器发酵罐萃取器蒸发器工业盐提炼工艺艺发冷冻干燥孢子琼脂斜面酵培养基制备无菌空气冷至15℃6.青霉素发酵工艺过程(1)、生产孢子制备斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养，最适温度25-26℃，培养6-8天，形成单菌落。再传斜面，培养7天，形成绿色斜面孢子。米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。6.2青霉素发酵工艺过程(2)、种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300-350rpm；pH自然，温度27±1℃,40h二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10％培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。通气量1:1-1.5；搅拌250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h(3)、生产罐培养工艺三级罐：生产罐；接种量20％培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.参数条件：通气量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小时:pH6.4-6.6，26℃；60小时后:pH6.7,24℃。6.3发酵培养与过程控制操作方式：反复分批式发酵发酵罐：100m3，装料80m3.带放:6-10次，带放量10％，间隔24h。发酵周期：180-220h发酵过程需连续流加葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。过程控制——补料分批操作控制基质浓度前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。a.流加碳源控制根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖0.3-0.6％左右，pH开始升高时流加糖。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。(1)培养基b.流加氮源控制玉米浆:最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素氨基氮浓度：0.01-0.05%。c.盐离子控制无机