芽孢杆菌胞外碱性蛋白酶的优化生产

芽孢杆菌胞外碱性蛋白酶的优化生产楚卫华摘要从牛奶加工厂、屠宰场附的水体和土壤中采集菌样，并分离出35株能够分泌碱性蛋白酶的菌株。枯草芽孢杆菌APP1菌株是碱性蛋白酶的高产菌株。将培养条件进行优化即可获得最高产量的蛋白酶。在50℃、pH9.0的条件下培养48小时，即可使培养物保持2,560U/ml的最高产酶活力。优化条件如下（/g）：豆粕15；小麦粉3；K2HPO44；Na2HPO41；MgSO4·7H2O0.1；Na2CO36。在SDS和氧化剂存在时碱性蛋白酶能够显示出极强的稳定性。将APP1菌株产生的碱性蛋白酶分别用5%的SDS和5%的H2O2处理72h，仍能保持73%以上的活力。关键词：芽孢杆菌产酶条件胞外碱性蛋白酶综述蛋白酶是最重要的工业用酶之一，约占世界上酶生产总量的60%。在各种蛋白酶中，微生物蛋白酶在生物技术的加工过程中具有重要作用。其中，碱性蛋白酶是一种重要的工业用酶，它们被广泛应用于洗涤剂、食品、药品以及皮革的生产制造，蛋白质的水解、电影工业以及工业废水的处理等领域。近年来，大量研究显示，从不同生物体如细菌、霉菌、酵母菌以及哺乳动物组织中获得的碱性蛋白酶具有不用的特性。虽然蛋白酶在自然界中的分布广泛，但微生物却是获得蛋白酶的首选。因为微生物的繁殖速度极快，占用的培养空间小，并且微生物为满足自身需要，在培养条件改变时易于获得转基因的新品种。在近期的研究中，我们报告的分离到的这个菌种（APP1），是一个生产胞外碱性蛋白酶的潜力菌株。材料和方法样本采集、分离和筛选从牛奶加工厂、屠宰场的排水沟中采集土样。用生理盐水稀释后，将1g土样置于蒸馏水的强力涡流中，静置后取0.1mL稀释液直接浇注到镀有酪蛋白的碱性固体琼脂培养基上。37℃条件下培养48h后，挑取单个菌落在碱性酪蛋白琼脂平板上划线分离，重复两次。挑取单菌落在脱脂牛奶的琼脂平板上划线培养。脱脂牛奶平板成分：蛋白胨(0.1%，w/v）,NaCl(0.5%，w/v),琼脂（2.0%，w/v），脱脂牛奶（10%，v/v）。根据培养后单菌落周围透明圈的大小，确定其产碱性蛋白酶能力的强弱，筛选出蛋白酶的高产菌株，进一步研究。菌种鉴定菌种鉴定是基于微生物的形态学特征以及生理生化特征，然后将测得的一系列数据与《伯杰氏系统细菌学手册》中记录的模式种对比，从而鉴定出菌种类别的方法[2]。蛋白酶的测定在0.1mol/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲液（pH11.0）中加入0.5％酪蛋白，进行碱性蛋白酶活性的测定[14]。一个酶活力单位是指在标准条件60℃下，每分钟催化1.0μmol底物转化为产物的酶量作为一个酶活力单位。酶的生产及优化从平板上选取透明圈大小合适的芽孢杆菌单菌落来研究蛋白酶活力。将菌落接种到TSB培养基平板上，置于4℃条件下培养。基本培养基配方（/g）：K2HPO44；Na2HPO41；MgSO4·7H2O0.1；Na2CO36；PH7.5。将碳酸钠溶液分别灭菌，然后添加到培养基中，取500ml烧瓶中培养24h的培养物1mL接种到培养基上（100ml）。在37℃下以250转/分的速度摇瓶培养48h。通过离心分离（8000g，4℃，20min）收集上清液，为酶活力的测定做准备。为了研究微生物的生长动力变化，吸取10%的菌悬液接种到100ml的灭菌培养基上，并于37℃下摇瓶培养24h（100rpm）。在600nm处对微生物的生长进行检测，然后收集样品并离心分离（6000rp，15min），收集上清液用于酶的测定。通过改变和控制培养基的条件，对烈性菌株进行详细的研究。优化培养条件，可以使蛋白酶的产量达到最高值。例如控制培养时间（12h，24h，48h，72h），培养基的pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0），培养温度（37℃，50℃，65℃，70℃），碳源（小麦粉，葡萄糖，乳糖，麦芽糖），氮源（蛋白胨，豆粕，酪蛋白，硫酸铵）（表一），并添加表面活性剂和氧化剂。记录这些因素对蛋白酶产量的影响。表一不同的碳源氮源对APP1菌株产蛋白酶能力的影响氮源浓度（%）蛋白酶活（U/ml）碳源浓度（%）蛋白酶活（U/ml）豆粕0.51,023小麦粉2.0678.41.52,5603.01,110.52.01,3644.0829.0蛋白胨1.0836.3麦芽糖0.51,025酪蛋白1.0650葡萄糖0.5850硫酸铵1.0160乳糖0.5510在基本培养基中分别添加各种氮源和碳源于37℃下培养48小时。结果鉴定菌种从牛奶加工厂和屠宰场的排水沟附近的土壤中采集五份样品，分离出35份能够产生碱性蛋白酶的微生物菌株。然后将菌株纯化，保藏菌种并测定其生产性能。在初步筛选中，APP1菌株显示出了更强的水解脱脂牛乳中酪蛋白的能力（图一），最后对该菌株生产胞外碱性蛋白酶的实验进一步优化。将获得的培养物保存在LB培养基上，于4℃下保藏。图二在牛奶琼脂平板上APP1菌株的水解图像表二中列出了APP1菌株的基本性状。它是一种好氧性的产芽孢的杆状细菌，能运动，属于芽孢杆菌属。孢子囊中含有椭圆形的末端孢子。表二枯草芽孢杆菌APP1菌株的基本特征细胞形态能游动，呈杆状，末端圆形。营养细胞大多以单细胞形态存在，有时也成对存在孢子囊末端膨大孢子呈椭球形（0.6-0.8×1.2-1.4μm）生长温度℃最高65-70，最低10-15革兰氏反应阳性营养琼脂（pH7.0）生长营养琼脂（pH7.0）添加2%NaCl缓慢生长营养琼脂（pH9.5-10.5）快速生长营养琼脂（pH10.0）添加7.5%NaCl生长对葡萄糖或酪氨酸培养基的颜色反应（pH10）阴性淀粉水解反应（pH10）阳性凝胶水解反应（pH10）强度液化酪蛋白水解反应（pH10）阳性橄榄油平板上的油脂消化反应阳性孵化时期对蛋白酶产量的影响为了确定最佳孵化时间，挑取单个APP1芽孢杆菌的菌落于液体培养基中培养1-3d，在孵化期的第2天产酶量达到最大值。随着孵化期的延长，生物量的合成也不断增加。4d后生物量的合成（600nm处的吸光度为7.2）达到了最大值，而且处于不同孵化期的微生物生长特点也不尽相同。碳源和氮源对蛋白酶产量的影响在有机氮源中，豆粕对胞外蛋白酶的产量有重要的影响。当将细胞培养在含有1.5%（w/v）豆粕的培养基中时，可以使酶的产量达到较高的水平。然而，酪蛋白、蛋白胨及硫酸铵对枯草芽孢杆菌APP1菌株蛋白酶的作用微弱。蛋白酶的产量分别比豆粕做氮源时少25.4%，33.7%，6.25%。在不同碳源试验中发现，添加3%的小麦粉可有效提高蛋白酶的浓度（1110.5U/ml）。除此之外，我们还测试了其他碳源对蛋白酶产量的影响。在培养基中加入0.5%的液体麦芽糖可以有效提高蛋白酶的产量。但是，葡萄糖和乳糖却可以使蛋白酶的产量分别降低17%和50%。所以通过优化实验方案，可以使胞外碱性蛋白酶的产量达到最高（1110.5U/mL）。酶的最适pH和最适温度在pH5.0-12.0的范围内研究微生物的生长及酶产量。pH9.0时为最适条件。随着碱性增强，达到pH10.0时，微生物的生长量和酶产量均开始下降。而且在酶水平上的减少量比生长量的减少量更显著（图二）。温度是影响酶产量的重要因素之一。在温度逐步上升到50℃时，酶产量开始随温度的升高而上升，但当温度继续上升超过65℃时，酶的产量却迅速下降（图三）。图二pH对蛋白酶活力的影响图三温度对蛋白酶活力的影响表面活性剂和氧化剂对酶产量的影响由芽孢杆菌APP1菌株产生的蛋白酶不仅对诸如TritonX-100和Tween-20之类的非极性表面活性剂表现出极强的稳定性，而且对SDS这种强极性表面活性剂同样有强稳定性。尤其是它对SDS表现出的强稳定性，将蛋白酶与5%的SDS混合72h，仍能恢复72%的活性。而且，蛋白酶与5%的过氧化氢混合72h后，其活性增强了。表三氧化剂和表面活性剂对APP1菌株产生的蛋白酶的影响表面活性剂/氧化剂浓度（%）保留酶活（%）无-100Triton-X-1001102.5Tween-201113SDS198.5573H2O211025110室温下，将蛋白酶用表面活性剂和氧化剂处理72小时，用标准测酶活法测定残余酶活力，用百分比定义酶活力。讨论许多微生物包括细菌、霉菌、酵母菌和哺乳动物的组织都能产生碱性蛋白酶。在细菌当中，枯草芽孢杆菌是碱性蛋白酶的特殊生产者[19]。目前主要的工业用酶是芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶。由于其产酶能力强，酶活力高以及酶对底物特有的专一性[12,13]，蛋白酶在工业上有着广泛的应用，如用于洗涤剂、制革、食品、污水处理以及肽的合成等各个方面。碱性蛋白酶主要由液态发酵剂制的。在商业生产上，经优化的培养基应保证各营养成分之间的平衡，这样才能在发酵结束时使未被利用的成分降至最低。我们重点研究了不同的碳源和氮源对微生物产酶的影响。在该文章中我们报告了一种新的枯草芽孢杆菌App1菌株，它在碱性培养基上生长时能够分泌高水平的碱性蛋白酶。碱性蛋白酶的产量很大程度上取决于碳氮比。由于豆粕价格低廉且适合作为培养基[5]，因此它是发酵生产胞外蛋白酶的最佳原料之一。实验表明，在枯草芽孢杆菌App1菌株的氮源测试实验中，豆粕是用于生产蛋白酶的有效底物。然而，对于枯草芽孢杆菌APP1菌株，添加酪蛋白和蛋白胨对蛋白酶的产量几乎没有影响。这与其他芽孢杆菌属[4,9]的表现相同。对于APP1菌株添加硫酸铵对蛋白酶的产量同样没有作用，这或许与其他的微生物有所不同。小麦粉和麦芽糖是最有利于产酶的原料。虽然葡萄糖不是最有利的原料，但是对于APP1菌株生产碱性蛋白酶来说，它仍能被良好地利用。然而，乳糖对蛋白酶的生产却具有消极作用。与此相反，Mabrouketal.[16]报道利用B.licheniformisATCC21415菌株生产蛋白酶，添加乳糖可以提高蛋白酶产量，但添加麦芽糖却会使产量降低。由APP1菌株生产的蛋白酶不仅对非极性的表面活性剂如Triton-X-100和Tween-20而且对强极性的表面活性剂如SDS均能显示出良好的稳定性和兼容性。Kobayashietal.[11]报导由枯草芽孢杆菌KSM-K16菌株生产的碱性蛋白酶，用5%的SDS处理4小时，仍能保留75%的活性。关于碱性蛋白酶对氧化剂的稳定性的一些早期报道显示，由枯草芽孢杆菌RGR-14菌株生产的碱性蛋白酶用1%的过氧化氢处理30分钟，其活性丧失近40%。然而，由芽孢杆菌KSMKP43菌株产生的一种类似芽孢杆菌蛋白酶的酶用10%的H2O2处理30min,其酶活力几乎不受影响。对比这些结果可知，由枯草芽孢杆菌APP1菌株产生的蛋白酶对表面活性剂和氧化剂，显示出极强的稳定性和兼容性。结论总之，这些有利的证据都显示枯草芽孢杆菌APP1菌株是一种能够产生碱性蛋白酶的新型菌株。其产酶的优化培养方案是在50℃、pH9.0的条件下培养48h，培养基成分如下(g-1）：豆粕15；小麦粉3；K2HPO44;Na2HPO41；MgSO4·7H2O0.1；Na2CO36。参考文献：1.BegKB,SahaiV,GuptaR(2003)StatisticalmediaoptimizationandalkalineproteaseproductionfromBacillusmojavensisinabioreactor.ProcessBiochem39:2003–22092.BergeyDH,HoltJG(1994)Bergey’smanualofdeterminativebacteriology,9thedn.Williams&Wilkins,Baltimore3.EllaiahP,AdinarayanaK,RajyalaxmiP,SrinivasuluB(2003)OptimizationofprocessparametersforalkalineproteaseproductionundersolidstatefermentationbyalkalopHilicBacillussp.AsianJMicrobiolBiotechnolEnv