第三章细胞破碎与分离.

第三章细胞破碎与分离3.1概述3.2细胞壁的结构及组成3.3细胞壁的破碎3.4细胞破碎技术的分类3.5包涵体的分离与蛋白质的复性3.1概述胞外产物霉菌产生糖化酶等胞内产物基因重组产品等分离纯化方法：⑴使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外⑵细胞破碎物理法，化学法，机械法，酶法不同类型的细胞分泌目标产物的类型：动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。植物细胞：多为胞内产物。微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。对于胞内产物，首先必须将细胞破碎。3.2细胞壁的结构及组成细胞壁的化学组成：微生物的类型年龄生长生理学3.2细胞壁的结构及组成图3.1细胞外层结构3.2细胞壁的结构及组成3.3细胞壁的破碎破碎方法的选择：破碎目的待破碎生物体的类型破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗；研究胞内产物在体内的功能，宜采用软处理。待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不同的敏感度3.3细胞壁的破碎细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号内数字不确切生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件，细胞壁结构，pH，温度以及细胞的变化也影响对破碎的敏感度3.4细胞破碎技术的分类分类破碎原理破碎技术举例机械法固体剪切作用珠磨法、x-press法液体剪切作用高压匀浆、超声破碎非机械法溶胞作用酶溶法、物理法、化学法膜失水作用干燥处理几种细胞破碎方法的比较3.4.1破碎率的评价破碎率的定义：N0：原始细胞数N：经t时间操作后，保存下来的细胞数N0和N的获取：直接计数法（平板计数，显微镜计数）间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量）电导率测定法%100(%)00NNNx3.1x＝R/RmR:破碎后释放的化合物的量Rm:理论最大释放量电导率测定法：细胞破碎后，大量带电荷的物质被释放到水相，使电导率上升，电导率随破碎率的增加呈线性增加。由于电导率与微生物的种类，处理条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解质含量有关，因此，正式测定应采用其它方法测定标准曲线。3.4.2破碎方法图3.4珠磨机简图㈠珠磨法生产厂商:瑞士WAB公司德国西门子机械公司形式：立式卧式（效率高）3.4.2破碎方法原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。㈠珠磨法珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为立式机中向上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化锆(密度为6.0g／cm3)微球(粒径约0.1～10mm)，填充率为80％～85％。3.3.2破碎方法动力学方程：遵循一级动力学方程㈠珠磨法1.3...)(RRkdtdRmR：t时间内释放的蛋白质数量（mg/g）Rm：能释放的蛋白质最大数量，即100％破碎k：破碎的比速率2.3...1100ktxLnkdtRRdRtRm其中：X＝R/Rm，破碎率3.4.2破碎方法影响破碎效率的因素：转盘外缘速度细胞浓度珠粒大小及装载量温度流速㈠珠磨法影响破碎效率的因素转盘外缘速度：在一定范围内，破碎的比速率与外缘速度成正比㈠珠磨法3.3...uk该式有一定的适用范围，转盘外缘速度增加到一限定值后，蛋白质释放就不再增加图3.5搅拌速率与蛋白质释放的关系－70%珠体积；－80%珠体积；－85%珠体积影响破碎效率的因素转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加，但产生的热量和消耗的功率也增加。破碎效率E被定义为：㈠珠磨法4.3...pRcqER：每Kg成品酵母释放的蛋白质数量q：物料通过量c：酵母的浓度P：5L珠磨机中，用于破碎所消耗的功率图3.6某一珠磨机下的效率在不同流量和搅拌速率影响破碎效率的因素细胞浓度：影响悬浮液的流变特性，从而影响蛋白质的释放，一般由实验确定一般控制在40％左右，细胞湿重/体积㈠珠磨法影响破碎效率的因素珠粒大小及装载量：过少不，不易破碎过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高，不利搅拌，一般控制80％～90%.㈠珠磨法图3.7微珠直径对破碎率的影响对细菌，磨珠越小，破碎率越高；对酵母和藻类，存在最佳范围实验室：0.2mm工业：不小于0.4mm影响破碎效率的因素温度：热稳定性，目的产物不受破坏夹套冷却㈠珠磨法影响破碎效率的因素流量：㈠珠磨法图3.8流量对破碎速率常数的影响处理能力但释放量破碎量QQVtQkQ影响破碎效率的因素微生物类型：酵母较细菌在珠磨机中更易破碎，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞的十分之一，在高速珠磨机中不易破碎。㈠珠磨法影响破碎效率的因素㈠珠磨法影响破碎效率的因素延长研磨时间，增加珠体装量，提高基本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率，使能耗加大。同时:1、产生较多热能，增加冷却控温的难度；2、大分子目的产物失活增加3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续操作带来困难。因此,破碎率控制在80％以下。㈠珠磨法3.4.2破碎方法图3.3HC23-高压细胞破碎机㈡高压匀浆法图3.4DY89-1型电动玻璃匀浆机作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50～70MPa。㈡高压匀浆法3.4.2破碎方法动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率X与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表达为：（服从一级反应规律)㈡高压匀浆法Nkpx11lnK:与温度，粘度等有关的速率常数：2.9（酿酒酵母）；2.21(大肠杆菌)3.4.2破碎方法影响细胞破碎的因素：温度压力循环操作次数细胞浓度阀座形式㈡高压匀浆法影响破碎效率的因素温度：破碎率随温度的增加而增加例如：操作温度由5℃增加到30℃，破碎率约提高1.5倍。高温对破碎有利，但应考虑热变性压力每增加10MPa，温度2℃。㈡高压匀浆法影响破碎效率的因素浓度：一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关Doulach等人通过理论分析，认为破碎率与细胞浓度存在下列关系：㈡高压匀浆法ZppR0exp1Z:常数；P：破碎压力；p0：临界压力；：取决于细胞浓度的参数；R:蛋白质的释放量影响破碎效率的因素压力：㈡高压匀浆法），能耗（每能耗磨损KW5.3MPa100TRP不能单纯追求高破碎率，随意增加操作压力。影响破碎效率的因素阀座形式：在相同的操作压力下，刃缘阀座比平边阀座破碎率高，但更易磨损。㈡高压匀浆法3.4.2破碎方法㈡高压匀浆法3.4.2破碎方法图3.5JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机㈢超声波法3.4.2破碎方法作用机理：在超声波作用下，液体发生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。㈢超声波法3.4.2破碎方法动力学方程：一级㈢超声波法)exp(1ktxx：蛋白质释放分率t：超声波发射时间（min）k：蛋白质释放常数(min-1),取决于输入声能3.4.2破碎方法超声波的负面影响：1、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却短期冷却与短期破碎交替负载因素：声波破碎/冷却的时间比率。2、超声处理会引起诸如游离基这样的化学效应，破坏目的产物，可加入游离基清除剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。㈢超声波法3.4.2破碎方法影响破碎细胞的因素：振幅：直接与声能有关，影响比速率k粘度：影响能耗，并抑制空穴现象表面张力：表面活性剂显著影响声波破碎效率，因起泡使蛋白质变性，空穴清除悬浮液体体积：大体积需要高的声能㈢超声波法3.4.2破碎方法影响破碎细胞的因素：加入珠粒体积与直径:加入细小珠粒，利于空穴形成，并有辅助“研磨效应”，提高破碎率。在相同珠粒填充密度下，随珠粒直径变化，k存在最大值。探头的材料和形状：选择具有良好声学和机械性能并对生物物质无毒的金属材料，如：钛，不锈钢等；探头的振幅与其面积呈反比，小直径探头，声能限制在较小范围内，并且效率低。细胞悬浮液的流速：流速增加，破碎率低，处理量大工业未使用，向大量悬浮液通入足够能量，很困难，产热问题。㈢超声波法3.4.2破碎方法机械法破碎细胞的优缺点：优点：内含物全部释放时间短，效率高，成本低通用性强，适于实验室和工业生产缺点：需要高的能量产生高温，高剪切力，引起产品变性失活非专一性，碎片分布宽，给分离造成困难3.4.2破碎方法作用机理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大脑内产物的遇透性。溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。酵母细胞的酶溶需用Zymo1yase(几种细菌酶的混合物)、-1,6—葡聚糖酶(或甘露糖酶）；破坏植物细胞壁需用纤维素酶㈣酶法胞溶3.4.2破碎方法优点：产品释放选择性高抽提速率和收率高产品破坏少pH、温度外界条件要求低不残留细胞碎片㈣酶法胞溶缺点：费用高通用性差存在产品抑制不适于工业生产3.3.2破碎方法应用：原生质体融合释放出克隆出的胞内蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物与机械法破碎细胞协同使用从细胞内不同的位置选择性的释放蛋白㈣酶法胞溶3.4.2破碎方法㈤化学渗透法某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）从而使胞内物质有选择的渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法Chemicalpermeation作用机理：化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂作用的部位和方式有所不同，现举例如下：（1）表面活性物质：可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。如TritonX-100能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。（2）EDTA螯合剂：可用于处理革兰氏阴性菌（如E.coli）,它对其细胞外层膜有破坏作用。（3）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。（4）变性剂：如盐酸胍(GuanidinHCl)和脲（Urea）与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。例：单独用0.1mol/L盐酸胍处理E.coli仅释放约1%的蛋白质0.5%TritonX-100处理蛋白质释放率3.4.2破碎方法优点：产物释放有一定的选择性不需要特殊设备细胞外形保持完整，细胞碎片少，浆液粘度低，利于后续分离㈤化学渗透法缺点：通用性差时间长，效率低某些化学试剂有毒3.4.2破碎方法应用：检测胞内酶活性释放胞内物质研究㈤化学渗透法3.4.2破碎方法渗透压冲击法：渗透压冲击(Osmoticshock)是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴性菌。㈥物理法3.4.2破碎方法冻融法：将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的琉水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，出于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂㈥物理法3.4.2破碎方法干燥法：将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗透性发生变化而破裂缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性㈥物理法3.4.2破碎方法比较项目机械法非机械法比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片细小碎片较大设备需专用设备不需专用设备内含物释放全部部分通用性强差粘度高（核酸多）低（核酸少）经济成本低成本