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第三章高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography本章内容：高效液相色谱概述高效液相色谱仪高效液相色谱的分类高效液相色谱分析方法高效液相色谱仪的维护与保养高效液相色谱商品仪器及厂商一、概述概念特点应用高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)一般指采用高压输液泵、高效分离柱、高灵敏检测器等仪器装置，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的一类液相色谱分析方法。高效液相色谱和经典液相色谱的比较“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）色谱柱流动相的推动力检测方式粗粒多孔固定相，大口径、长玻璃柱管全多孔微粒固定相，小口径，短不锈钢柱管HPLC依靠重力让溶剂流下，分离速度慢，分析时间长(1～20h)采用高压泵输送流动相，可准确控制流速，分析速度快(0.05～1h)HPLC用于混合物的分离，一般分离和检测过程独自将柱分离技术与光学检测器联用，使得液相色谱从最初的以分离目的为主，发展为可以同时完成分离分析HPLC高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和天然产物；合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型化合物。在生命科学领域的应用氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物质的纯化和分析。药物分析合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析。除聚合物外,约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析。高效液相色谱法测定野蕨菜氨基酸成分色谱条件：ShimpackCLCCN色谱柱，(150mm×6.0mm,5μm)，流动相：正己烷-乙醇-甲醇(87.8∶10.2∶2,V/V/V)；流速1.10mL·min-1；检测波长240nm；柱温40℃。同时测定人血浆中地西泮、硝西泮、氯硝西泮、咪达唑仑、三唑仑、艾司唑仑和阿普唑仑7种药物的浓度磺酸酯在HPLC上的手性分离食品分析①食品本身组成,特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析同时测定鳗鱼中磺胺嘧啶（ＳＤ）、磺胺甲基嘧啶（ＳＭ１）、磺胺二甲嘧啶（ＳＭ２）、磺胺甲氧嗪（ＳＭＰ）、磺胺甲噁唑（ＳＭＺ）、磺胺间甲氧嘧啶（ＳＭＲ）、磺胺间二甲氧嘧啶（ＳＤＭ）、磺胺喹噁啉（ＳＱＸ）8种磺胺类药物环境监测该法特别使用于分子量大,挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药等。图1十六种PAH标样的HPLC紫外谱图图2十六种PAH标样的HPLC荧光谱图以标准谱图相对照。图1和图2为十六种PAH标样在ZorbaxODS柱的HPLC图，出峰顺序为1.萘，2.苊烯，3.苊十芴，4.菲，5.蒽，6.荧蒽，7.芘，8.苯并(a)蒽十枹，9.苯并(b)荧蒽，10.苯并(k)荧蒽，11.苯并(a)芘，12.二苯并(a，h)蒽，13.苯并(ghi)苝，14.茚并(1,2,3-cd)芘。水质:多环芳烃的测定精细化工产品分析具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品制备分离应用在许多科学研究和生产领域，往往需要制备或提取一些高纯化合物。色谱过程是一特殊的动态多次重复分离过程：从进样阀引入的样品组分被流动相带入色谱柱。由于不同组分与流动相和固定相的分子间作用力不同，它们在色谱柱的移动速度不同，先后流出色谱柱进入检测器。由检测器记录分离过程--色谱图。1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置在线脱气机色谱泵及控制器进样器检测器数据处理及控制色谱柱流动相脱气装置目的：使色谱泵的输液准确—脉动减少；保留时间及色谱峰面积重现性提高提高检测性能—防止气泡引起的尖峰；基线稳定保护色谱柱—减少死体积；防止填料的氧化惰性气体脱气法：向溶剂中吹入氦气等小分子气体，以使溶解在流动相中的空气等气体脱出。超声波脱气法：将溶剂瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气，一般500mL流动相超声20～30min。此法方便，不影响流动相的组成，适用于各种流动相脱气。抽真空：溶剂抽滤在线脱气：可保持连续脱气。（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。选择流动相时应注意的几个问题：高压输液系统：一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。要求：泵体材料能耐化学腐蚀。能在高压下连续工作。通常要求耐压40～50MPa·cm-2。输出流量范围宽。一般为0.1～10mL/min。输出流量稳定，重复性高。流量控制的精密度应小于1%高压泵要求：泵体材料能耐化学腐蚀。能在高压下连续工作。通常要求耐压40～50MPa·cm-2。输出流量范围宽。一般为0.1～10mL/min。输出流量稳定，重复性高。流量控制的精密度应小于1%（动画1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）梯度洗脱梯度洗脱指采用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续变化流动相组成比和极性的一种洗脱模式。对于复杂混合物，特别是保留性能相差较大的混合物的分离梯度洗脱是一种极为重要的手段。特点（1）改善分离,加快分析速度；（2）改善峰形,减少拖尾,有利于痕量组分的检测梯度洗脱进样系统：不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱高效液相色谱仪采用阀进样方式。分手动进样和自动进样1）液相色谱进样针：平头，25、50和100μl等2）阀进样（环路进样器）进样量大小通过选择不同体积（1～100μl）的定量管决定。当进样阀手柄置于“取样（load）”位置时，用特制的平头注射器将样品液注入取样管。再将进样阀手柄转向“进样（inject）”位置时，流动相将样品掖携带进入色谱柱进行分离。3）自动进样器在程序控制器或计算机控制下可自动完成取样、进样、清洗等一系列操作，一次可进行几十个或上百个样品的分析。（动画2）自动进样装置分离系统：色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。操作注意：流动相的转换流速的变化幅度温度变化幅度专用色谱柱：样品及溶剂的要求有机——有机溶剂：直接转换有机——缓冲溶液：用纯水过渡记住：拿到一根新柱一定要先看使用说明检测器：利用被测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被测物从色谱柱上流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰形式表现出来。检测器选择性用于梯度洗脱线性范围对适合样品的敏感性检测限(g/ml)对流速对温度紫外紫外吸收可以1052×10－10不敏感低示差通用型不可以1042×10－7不敏感10－4荧光发荧光物质可以10310－11不敏感低电化学电活性不可以10610－12敏感1.5%电导离子不可以2×10410－8敏感2%几种主要检测器的基本特性紫外吸收检测器（UV-VIS）具有灵敏度高，线性范围宽，对流动相基本无响应，对流速和温度不敏感等特点，它是液相色谱最常用的检测器。固定波长型：光源波长固定，一般为254nm，简单、灵敏。可变波长型：常规氘灯（紫外光源）的使用范围195～400nm扫描型或二极管阵列：可以瞬间实现紫外可见光区的全波长扫描，得到时间－波长－吸收强度三维色谱图。样品池紫外光度检测器光路图：（动画3）紫外检测的主要参数是选择检测波长应考虑溶质和流动相的吸收特性：常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其他目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长；应尽可能选择检测波长下没有背景吸收的流动相光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。示差折光检测器（refractiveindex，RX）除紫外检测器之外应用最多的检测器。通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器折射率对温度的变化非常灵敏，检测器必须恒温灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。荧光检测器（fluorescencedetector，FLD）它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱和甾族化合物等荧光检测器是一种很灵敏的,有选择性的检测器,其灵敏度比UV高10~1000倍,一般可测ppb级的化合物电化学检测器（electrochemicaldetector，ECD）对于具有电活性的物质,在液相色谱中可采用电化学检测器检测。它包括电导库仑、安培、极谱、电位和光电导等形式；具有高选择性、高灵敏度、低造价等优点。联用检测器液相色谱仪与质谱联用与红外光谱仪联用与核磁共振联用与原子吸收、原子发射光谱仪联用等工作站所有分析过程都可在线模拟显示，数据自动采集、处理和存储，并对整个分析实现自动控制。Millennium32处理软件一、按分离过程的物理化学原理分类吸附色谱(AdsorptionChromatography)分配色谱（PartitionChromatography）离子交换色谱（IonExchangerChromatography）空间排阻色谱（SizeExclusionChromatography）亲合色谱（AffinityChromatography）二、按实际应用色谱类型分类正相色谱与反相色谱离子对色谱离子交换色谱和离子色谱空间排阻色谱手性色谱电色谱等三、分离类型的选择吸附色谱(AdsorptionChromatography)用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在吸附剂上吸附力的大小来进行分离的色谱方法流动相活性吸附点固定相液固吸附色谱分配色谱（PartitionChromatography）用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在固定液中溶解能力大小，即在固定相和流动相间的分配系数大小来进行分离的色谱方法。液液分配色谱离子交换色谱（IonExchangerChromatography）用离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。离子交换色谱空间排阻色谱（SizeExclusionChromatography）用化学惰性多孔物质作固定相，样品中各组分依据它们在流动相的分子体积大小来进行分离的色谱方法。以水溶液作流动相的排阻色谱称为凝胶过滤色谱（GelFitrationChromatography）；以有机溶剂作流动相的排阻色谱称为凝胶渗透色谱（GelPermeationChromatography）。排阻色谱亲合色谱（AffinityChromatography）用固相基体上固载化生物特异性吸附的配位体作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中