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第三章酶（Enzyme）豌豆的根瘤第一节酶概述第二节酶促反应动力学第三节酶的专一性和活性中心第四节酶的作用机理第一节酶概述酶的定义酶是生物催化剂酶的化学本质酶是活细胞内产生的具有高度专一性和催化效率的蛋白质，又称为生物催化剂；酶主要是在细胞内起催化作用；有些酶合成后释入血液或消化道，并在那里发挥其催化作用；人工提取的酶在合适的条件下可在试管中对特殊底物起催化作用。酶的定义及发展二千余种酶被鉴定出来，其中有二百余种得到结晶，特别是近三十年来，随着蛋白质分离技术的进步，酶的分子结构、酶作用机理的研究得到发展，有些酶的结构和作用机理已被阐明。总之，随着酶学理论不断深入，必将对揭示生命本质研究作出更大的贡献。酶是生物催化剂（Biologicalcatalyst）酶与一般催化剂的共性1、促进热力学上允许进行的反应2、反应前后无质和量的改变，用量少，催化效率高3、缩短达到化学平衡的时间，不改变化学反应的平衡点4、可降低反应的活化能比一般催化剂更有效地降低反应的活化能酶是生物催化剂（Biologicalcatalyst）酶与一般催化剂的区别—酶的特性高度的催化效率高度的专一性（特异性）：绝对特异性(absolutespecifictity)相对特异性(relativespecificity)立体异构特异性(stereopecificity)酶活性的可调节性酶活性的不稳定性催化效率比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高106～1012倍酶蛋白蛋白质部分+非蛋白质部分+辅助因子=全酶（有活性）结合酶单纯酶小分子有机化合物（B族维生素）无机金属离子辅酶辅基酶酶的化学本质辅助因子常见：维生素及其衍生物常见：K+,Na+,Mg2+,Cu2+,Zn2+,Fe2+金属离子小分子有机化合物辅基(prostheticgroup):共价键；结合紧密不可用透析或超滤除去辅酶(coenzyme):非共价键；结合疏松可用透析或超滤除去辅助因子分类组成or第二节酶促反应动力学一、底物浓度对反应速度的影响二、pH对反应速度的影响三、温度对反应速度的影响四、酶浓度对反应速度的影响五、抑制剂对反应速度的影响六、激活剂对酶促反应速度的影响酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。影响因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。一、底物浓度对反应速度的影响在酶的浓度不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的作用呈现矩形双曲线(rectangularhyperbola)1913年Michaelis和Menten提出解释酶促反应中底物浓度和反应速度关系的最合理学说是中间产物学说。反应速度和底物浓度关系的数学方程式，即著名的米氏方程michaelismentenequation)：米氏方程（Michaelisequation)----解释[S]和V之间的关系Vmax[S]Km+[S]V=V：不同[S]时的反应速度Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)[S]：底物浓度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)米氏常数的意义（1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。（2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。（3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关。（4）Km表示酶和底物的亲和力。Km越大，表示和底物的亲和力越小。如果Km值已知，任何底物浓度时酶的饱和度(形成中间产物的酶占酶的比例，saturationfraction)fEs便可计算出来。fES=［ES］／［Et］=K3［ES］／K3［Et］＝V／Vmax=[S]／Km+[S]Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。但是KS值并非在所有酶促反应中都远小于K2，所以Ks值(又称酶促反应底物常数)和Km值的涵义不同，不能互相代替使用。Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M必须指出米氏方程只适用于较为简单的酶作用过程，对于比较复杂的酶促反应过程，如多酶体系、多底物、多产物、多中间物等，还不能全面地籍此概括和说明，必须借助于复杂的计算过程。二、pH对反应速度的影响酶反应介质的pH可影响酶分子，特别是活性中心上必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态，也可影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合。只有在特定的pH条件下，酶、底物和辅酶的解离情况，最适宜于它们互相结合，并发生催化作用，使酶促反应速度达最大值，这种pH值称为酶的最适pH(optimumpH)。它和酶的最稳定pH不一定相同，和体内环境的pH也未必相同。也就是说，最适pH有时因底物种类、浓度和缓冲液成分不同而不同；而且常与酶的等电点不一致，因此，最适的pH并不是一个常数，只是在一定的条件下才有意义。胰蛋白酶最适pH动物体内多数酶的最适pH值接近中性(6.5-8)，但也有例外;植物及微生物酶多在pH4.5-6.5，溶液的pH值高于和低于最适pH时都会使酶的活性降低，远离最适pH值时甚至导致酶的变性失活。测定酶的活性时，应选用适宜的缓冲液，以保持酶活性的相对恒定。最适pH是不是酶的特征性常数？它受哪些因素影响？pH影响酶活力的可能因素过酸、过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活；当pH改变不很剧烈时，酶虽不变性，但活力受影响；Why？pH影响分子中另一些基团的解离，这些基团的离子状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。三、温度对反应速度的影响化学反应的速度随温度增高而加快。但酶是蛋白质，可随温度的升高而变性。在温度较低时，前一影响较大，反应速度随温度升高而加快，一般地说温度每升高10℃，反应速度大约增加一倍。但温度超过一定数值后，酶受热变性的因素占优势，反应速度反而随温度上升而减缓，形成倒V形或倒U形曲线。在此曲线顶点所代表的温度，反应速度最大，称为酶的最适温度(optimumtemperature)。Differentturn-overratiosofanenzymeatdifferenttemperatures.酶的最适温度不是酶的特征性常数，这是因为它与反应所需时间有关，不是一个固定的值。酶可以在短时间内耐受较高的温度，相反，延长反应时间，最适温度便降低。在一定的温度和pH条件下，当底物浓度大大超过酶的浓度时，酶的浓度与反应速度呈正比关系五、激活剂对酶反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质都称谓激活剂（activator），其中大部分是离子或简单有机化合物。一、无机离子1）金属离子；2）阴离子；3）氢离子。二、有机分子1）一些还原剂2）EDTA（乙二胺四乙酸）三、具有蛋白质性质的大分子物质金属离子对酶的作用有哪些？EDTA提高酶活力的作用机理六、抑制剂对反应速度的影响酶是蛋白质，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用；凡可使酶的活性下降但不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用(inhibition)。抑制作用和变性作用不同。凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称做酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不(一)不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)概念：抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，不能用透析、超滤等物理方法将其除去。常见抑制剂：巯基酶抑制剂丝氨酸酶抑制剂碘乙酸（ICH2COOH）是一种烷化剂，可使巯基烷化：E-SH+I-CH2COOH→E-S-CH2COOH+HI所以它是巯基酶的抑制剂。如抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶、脲酶、a-淀粉酶等利托那韦，Ritonavir(二)可逆性抑制(reversibleinhibition)抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。1、竞争性抑制•抑制剂结构与底物结构相似，互相竞争酶的活性中心，从而抑制酶的活性ESEEE+SESE+PI+EISII竞争性抑制作用特点1.i与S结构相似；2.i与S互相竞争与酶结合；3.抑制程度取决于[S]和[i]的相对比例；4.↑[S]，可以减少或去除抑制作用。（Km↑，Vm不变）2、非竞争性抑制作用抑制剂和底物结构不相似，两者互不干扰同时与酶结合，从而抑制酶活性。E+SESE+P+I+IEI+SESIESI非竞争性抑制作用特点1.i与S结构不相似；2.i与S互不干扰同时与酶结合；3.抑制程度只取决于[i]的浓度；4.↑[S]，不能去除抑制作用。（Km不变，Vm↓）非竞争性抑制作用竞争性抑制作用3、反竞争性抑制作用抑制剂仅与酶-底物复合物（ES）结合，使酶失去催化活性E+SESE+P+IESI一些重要的抑制剂：1不可逆抑制剂：a）有机磷化合物；b）有机汞、砷化合物；c）氰化物；d）重金属；e）烷化剂；f）有活化作用的不可逆抑制剂2可逆抑制剂磺胺药；氨基乙酸；胆碱脂酶。第三节酶的专一性和活性中心酶的专一性酶的活动中心酶的专一性分类：1）结构专一性绝对专一性（Absolutespecificity）族（基团）专一性相对专一性键专一性一、酶的底物专一性酶底物的专一性（Substratespecificity）是指酶对它的底物有严格的选择性，一种酶只能催化某一类，甚至只与某一种物质起化学变化。2）立体结构专一性（Stereospecificity）旋光异构专一性几何异构专一性“诱导楔合”假说（induced-fithypothesis）酶作用专一性假说1958年，Koshland提出底物（S）和酶蛋白相互接近时，诱导酶蛋白发生空间构象的变化，而底物也可以变形适应酶的变化，它们相互诱导、相互变形、相互适应，进而相互结合二、酶的活动中心指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。（1）酶活性中心的组成：由一些氨基酸残基的侧链基团组成。对于结合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。这些基团在一级结构上可能相距很远，甚至可能不在一条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，形成具有一定空间结构的区域。（2）酶活性中心的特点2.都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状，但不是刚性的，而具有一定的柔性。3.活性中心为非极性的微环境，有利于与底物结合。1.活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分（约1%2%），相当于23个氨基酸残基。4.底物与酶通过形成较弱键力的次级键，相互作用并结合到酶的活性中心。5.酶的活性部位并不是和底物的几何图形正好吻合，而是在酶与底物结合的过程中，底物分子或酶分子或它们两者的构象同时发生一定变化后才相互契合，这时催化基团的位置也正好处于所催化底物的敏感化学键部位。活性中心有两个功能部位：一个是结合部位，一定的底物靠此结合到酶分子上；一是催化部位，底物的健在此处被打断或形成新的键，从而发生一定化学变化。一个酶的催化部位可以不止一个。有些酶的分子表面除了活性中心外，还具有重要的功能部位——调节中心底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心Enzymesareproteins.Thefunctioningoftheenzymeisdeterminedbytheshapeoftheprotein.Thearrangementofmoleculesontheenzymeproducesanareaknownastheactivesitewithinwhichthespecificsubstrate(s)willfit.Itrecognizes,confinesandorientsthesubstrateinaparticul