第二代DNA测序技术

1第二代DNA测序技术第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（SequencingbySynthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。现有的技术平台主要包括Roche454FLX，IlluminaSolexa，AppliedBiosystemsSOLID。概述1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法；同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。第二代测序技术：费用更低、通量更高、速度更快。1、454FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；2、Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；3、SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。基本原理Illumina/SolexaGenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。操作流程1）测序文库的构建（LibraryConstruction）首先准备基因组，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头（或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头）。片段的大小（Insertsize）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insertsize，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。2）锚定桥接（SurfaceAttachmentandBridgeAmplification）Solexa测序的反应在叫做flowcell的玻璃管中进行，flowcell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3）预扩增（DenaturationandCompleteAmplification）添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双2链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4）单碱基延伸测序（SingleBaseExtensionandSequencing）在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做BaseCalling，Illumina公司BaseCalling所用的软件是Illumina’sGenomeAnalyzerSequencingControlSoftwareandPipelineAnalysisSoftware。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5）数据分析（DataAnalyzing）这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。3高通量测序又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：①大规模平行签名测序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、②聚合酶克隆测序（PolonySequencing）、③454焦磷酸测序（454pyrosequencing）、④Illumina(Solexa)sequencing、⑤ABISOLIDsequencing、⑥离子半导体测序（Ionsemiconductorsequencing）、⑦DNA纳米球测序（DNAnanoballsequencing）。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。实验过程1.样本准备（samplefragmentation）2.文库构建(librarypreparation)3.测序反应(sequencingreaction)4.数据分析(dataanalysis)测序平台罗氏公司(Roche)的454测序仪(RocheGSFLXsequencer)Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（GenomeAnalyzerplatform）ABI公司推出了自主研发的SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer)公司名称技术原理技术开发者(ABI)基于磁珠的大规模并行克隆连接DNA测序法美国Agencourt私人基因组学公司Illumina合成测序法英国Solexa公司首席科学家Roche大规模并行焦磷酸合成测序法美国454LifeSciences公司的创始人Helicos大规模并行单分子合成测序法美国斯坦福大学生物工程学家CompleteGenomicsDNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法CompleteGenomics公司首席科学家4IlluminaGenomeAnalyzerIIx测序原理Illumina公司的新一代测序仪Hiseq2000和Hiseq2500具有高准确性，高通量，高灵敏度和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flowcell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。技术应用测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（denovosequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（wholetranscriptomeresequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（smallRNAsequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。目标序列捕获测序技术（TargetedResequencing）--是由第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。目前，高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion综合征中的致病突变，他们使用Agilent序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序，平均覆盖度为43倍，读长为50nt，每个个体产生了2.7-3GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因，最终将候选基因缩小至1个。以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中，目前科学界所说的高通量测序指的是第二代测序。