Chapter3DNA的复制DNAReplicationWatson&Crick:一种遗传物质,必须能行使两种功能,即自我复制和对细胞的高度特异性的影响。遗传物质的基本属性:•基因的自我复制•控制性状的表达3.1基本概念DNA复制:亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下,分别以每单链DNA分子为模板,聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。3.1.1复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求超螺旋线状,开环状多种复制相关的蛋白是如何作用的?复制的准确性:修复、校正DNA复制速度:E.coli高速解旋112km/h?3.1.2复制起点与方向(replicationorigin&direction)复制起点的特征richAT&palindromATrich“呼吸现象”•DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生,导致两条DNA链不断解链与聚合,形成瞬间的单泡状结构的过程。•在富含AT的区域内尤为明显。3.1.3复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向细菌一般单起点,哺乳动物50000-100000个复制起点3.1.4子链DNA延伸方向5’OHTCATCAC5’OH3’pppOHC++ppiDNApolymerasereactsonthe3’endonlyNewDNAelongationfrom5’to3’direction进化中保留的深刻的、选择与适应的、化学及功能的根源如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG+5’pppOH3’GpppOHG5’ppp因能量的需要,DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中,磷酸基团间的强电负性,使dNTP难以聚合到DNA的5‘端,而且双链DNA的5’端碱基配对困难。碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3.1.5半保留复制(Semi-conservativereplication)半保留复制的证实MeselsonandStahl,1958Heavyisotope15NNormal14NCsCl密度梯度离心3.1.6半不连续复制(Semi-discontinuousreplication)3’3’3’3’5’5’5’5’两端复制假说实验结果证明,DNA分子在任何时刻都只有不到5%处在单链状态。推翻了该假说。冈崎片段(Okazakifragment)5‘3’5’3‘5‘3’5’3‘AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kbDNAreplicationinOkazakifragment1kb3.1.7复制体(replisome)进化中形成了灵活的多酶复合体。组成TopI,TopII,SingleStrandBindingprotein(SSB)DnaB,DnaC,PrimaseDNAPolymeraseIIIDNAPolymeraseILigase3.2原核细胞的DNA复制DNA聚合酶Ⅰ•由一条多肽链构成。并不是大肠杆菌DNA复制中主要的DNA合成酶,它的主要作用,是切除RNA引物、填补空缺和DNA损伤的修复。DNA聚合酶Ⅱ•由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外,还具有3′→5′外切酶活性。主要在DNA损伤修复中起作用。DNA聚合酶Ⅲ•此酶是一个多聚酶,由10种以上不同亚基组成的。全酶成不对称的二聚体,围绕着DNA双螺旋,每个单体都具有催化活性,一个作用于前导链,另一个作用于随从链,使DNA两股链在同一位置同一时间进行合成。3.2.1主要复制酶类DNA聚合酶Ⅲ结构图3.2.2复制叉的形成OriC复制起点序列DnaADnaB/CDnaB蛋白:解旋酶(helicase)DnaA蛋白:辨认复制起始点DnaC蛋白:辅助DnaB在起始点上结合并打开双链3.2.3复制的起始引发体:•引物酶(Primase)3.2.4DNA的促旋酶(Gyrase)GyraseDNA在解链的过程中,会增加链的正超螺旋,Gyrase(TypeIItopoisomerase)将解决该问题。3.2.5复制的延伸真实的延伸真实的延伸3.2.6滞后链的完整复制PolymeraseIIIholoenzyme(DNApolIII)DNApolI(5’3’exonulcleaseactivity)DNApolI(5’3’polymeraseactivity)DNAligase(NAD+)3.2.7复制的终止与分离依赖于tus基因的产物AttachmentofbacterialDNAtothemembranecouldprovideamechanismforsegregation3.2.8甲基化可以控制复制起始11copiesinOriCRe-initiationofbacterialreplicationatneworiginsTer(terminus)O(origin)3.2.9滚环复制(特殊复制模型)D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rollingcyclingamplification5‘3‘3‘3‘3.2.10复制的速度E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell22-25hrs500-5000bp/min140公里/小时3.3真核DNA的复制DNAreplicationatphaseSofcellcycleS6-8hsM1hG23-4hsG112hsG1preparingforDNAreplication(cellgrowth)SDNAreplicationG2ashortgapbeforemitosisMmitosisandcelldivision3.3.1真核生物与原核生物复制子的比较3.3.2真核细胞DNA复制的起始大约20-50串联复制子在S-phase同时起始复制。S-早期:常染色质复制S-后期:异染色质复制中心粒和端粒的最后复制3.3.3DNA复制酶类DNA聚合α•主要是引物合成DNA聚合δ•主要负责DNA复制的酶,参与先导链和滞后连的合成DNA聚合ε•主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口补全DNA聚合γ•线粒体DNA的复制DNA聚合β•可能在DNA损伤的修复中起作用3.3.4真核DNA复制酶的主要特点DNA聚合酶α合在RNA引物及一小段DNA(intratorDNA,iDNA),形成RNA-DNA引物,然后DNA聚合酶α转换为DNA聚合酶δ,再由DNA聚合酶δ负责延伸前导链及冈崎片段。DNA聚合酶δ无合成引物功能,只能有效地延伸DNA引物,对RNA引物延伸功能很弱。3.3.5DNA复制过程中的组蛋白复制经过时,DNA从组蛋白上解离当复制叉通过以后,组蛋白立即结合上去DNA复制的同时,新的组蛋白也在合成3.3.6端粒的复制3’-OH?3‘5‘5‘3‘3’-OH?四膜虫属的断粒酶作用GGhoogsteenbondTetraplexhelixG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGC链--A2C4-----G链–T2G4-----TTGGGGttggggttgC链--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolor5‘3‘TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTGGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色体端粒DNA结构结构特点LinkedbyHoogsteenBondingGGGGTelomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值细胞分裂次数与端粒长短呈正比端粒长短端粒酶活Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度长短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老XXXY