第二章发酵工业菌种.

第二章发酵工业菌种发酵工业菌种概述发酵工业菌种的分离筛选发酵工业菌种鉴定发酵工业菌种改良发酵工业菌种保藏第一节发酵工业菌种概述发酵工业应用的微生物种类很多，可分为两大类：可培养微生物和未培养微生物。可培养微生物通常分为四类：细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌。一、细菌以二分裂为主要繁殖方式的单细胞原核微生物。细菌是自然界中分布最广、数量最大、与人类关系极为密切的一类微生物。细菌的形态细菌的三种主要形态：球形（球菌）杆形（杆菌）螺旋形（螺旋菌）细胞形态基本保持恒定。工业生产常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生产各种酶制剂、有机酸、氨基酸、肌苷酸等。细菌常用在基因工程载体的宿主细胞，用于构建基因工程菌来生产外源物质，如利用大肠杆菌生产核酸和蛋白质疫苗。二、放线菌一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。单细胞结构革兰氏阳性产生多种物质放线菌病横隔分裂缩缢分裂分生孢子孢子囊孢子无性孢子（主要）菌丝片段放线菌的繁殖放线菌的最大经济价值就在于能产生多种抗生素。从微生物中发现的抗生素有60%是放线菌产生的如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。常用的放线菌主要来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。三、酵母菌酵母菌是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真菌的总称酵母菌超过600种，分属于39个属。主要分布是在含糖量较高的、偏酸性的环境中；酵母菌的最适温度是25--30℃；人类实践中应用较早的微生物工业生产中常用的酵母有啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等。四、霉菌霉菌是丝状真菌的一个俗称，即引起物品霉变的真菌通常指那些菌丝体较发达又不产生大型肉质子实体结构的真菌。1、青霉（自然分布广，产青霉素）2、曲霉（产酶制剂）3、毛霉分解蛋白能力强，制腐乳。糖化能力强，酒精发酵原料的糖化引起食物腐败。五、未培养微生物迄今所采用的微生物纯种培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，在自然界微生物群落中占有非常高的比例（99%）。未培养微生物广泛存在于各种极端环境（高温、低温、高盐、高压、高辐射以及较强的酸碱环境）中。第二节菌种分离一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。将混杂在各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、有效、准确的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程就叫做菌种分离。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速的从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，一定要有很强的选择性和高灵敏度。发酵工业对菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物，易于回收有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染它种微生物或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）生产特性要符合工艺要求二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采样富集培养纯种分离菌落的选择生产性能测定纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落。测定代谢产物或其它目的性状让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。有针对性地采集样品利用筛选模型，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株采样1、采样对象以采集土壤为主。根据微生物营养类型。根据微生物的生理特性。极端环境条件下。采样2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。物理方法：加热、膜过滤和离心法等通过定向培养的方法：富集方法（enrichement）5、抑菌剂纯种分离1．稀释分离法2．平板划线分离法⑴涂菌：⑵划线分离：菌落的筛选-筛选依据从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。菌落的筛选方法——分初筛和复筛初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。菌落直接涂布法琼脂挖块法纸片法菌落的筛选方法——分初筛和复筛复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。一般是将初筛菌株接入液体培养，当目的产物达到高峰时期，终止培养，用精确的检测手段，进行目的产物的定量测定。变色圈法在底物平板中加入指示剂或显色剂使所需微生物很快鉴别出来.实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）→80度30分钟处理0.02%刚果红＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，纤维素水解酶能够水解此糖苷键使其变成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类同刚果红染料可形成红色沉淀，根据圈的大小选择菌落。↓从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型例糖苷酶抑制剂产生菌的筛选该模型是将放线菌发酵液浸润的小圆纸片，置于能产生糖苷酶而利用淀粉的酵母琼脂平板上，培养过夜后，平板培养基中的淀粉被酵母利用，当向平板中注入碘液时，如果在纸片周围出现蓝色的显色圈，说明纸片上存在糖苷酶抑制剂，抑制了淀粉的水解，并可根据显色圈的大小判断菌株产生的该抑制剂的活性高低。透明圈法:在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊,能分解底物的微生物便会在菌落周围形成透明圈。例.-淀粉酶的筛选将适当稀释的样品，涂布在以淀粉为碳源的培养基上，生长后可见水解圈，碘染色后水解圈更清晰可见，根据圈的大小，选择菌落。例、蛋白酶产生菌的分离筛选1）样品采集2）含酪蛋白培养基进行微生物的培养分离3）根据水解圈的大小筛选酶活高的菌株生长圈法：通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等生长因子产生菌。辅助菌是相对应的营养缺陷型菌株。将待筛菌株涂布于（纸片）含高浓度的辅助菌并缺少辅助菌所需营养物的平板上培养，若待筛菌可合成目的产物，在该菌株周围便可形成一个浑浊的生长圈。抑菌圈法：抗生素的筛选。工具菌采用抗生素敏感菌，将待筛选菌涂布于（或用纸片浸润发酵液贴于）含有工具菌的平板上，若待筛选菌能分泌抗菌物质，在菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例：醛肟水解酶的筛选环保降解菌筛选：采用以该物质为唯一碳源或氮源的液体培养基上进行培养，能分解该物质的微生物正常生长，其他菌则被淘汰。培养基中含0.05%ofZ-PAOx每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落浓度梯度法产物合成能力与抗自身产物能力有关有毒物质的降解能力与抗此毒物能力有关下层加入抗性物质上层不加入抗性物质梯度培养皿平板制备梯度平板上菌落生长情况高浓度低浓度第三节菌种鉴定细胞水平：形态、运动、营养、生长等细胞组分水平：细胞壁、抗原性等蛋白质水平:氨基酸分析、免疫标记等核酸水平：G+C%、分子杂交、rRNA鉴定步骤获得纯培养物测定一系列必要的鉴定指标查找权威性的菌种鉴定手册一、经典的鉴定指标形态、生理、生化反应、生态特征、生活史、血清学反应、噬菌体敏感性最常用、最重要、最方便也是现代化分类鉴定的依据二、分类鉴定中的现代方法（一）核酸分析鉴定法（二）细胞化学成分鉴定法（三）数值分类法（一）核酸分析鉴定法1、DNA碱基G+C%比例的测定2、核酸分子杂交法3、rRNA寡核苷酸编目分析4、微生物全基因组序列测定1、DNA碱基G+C%比例的测定简称GC比（G+C）%=——————X100%亲缘关系相近的种ＧＣ比也相近ＧＣ比差别大亲缘关系必然远种内差距2.5-4.0％,种间5%,属间差距10%G+CA+T+G+C测定G+C%一般采用解链温度法TmTm高G+C%高（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44一些微生物的G+C含量菌种G-C含量（mol%）细菌大肠杆菌50~52伤寒沙门氏杆菌50~53短乳杆菌45.5铜绿假单胞菌64~67放线菌灰色链霉菌69.5~73丙酸放线菌66.5星状诺卡氏菌64~69.5霉菌米曲霉52.5产黄青霉51~54.5大毛霉29.52、核酸分子杂交法DNA-DNADNA-rRNArRNA-rRNA方法:待测菌株dsDNA----ssDNA参照菌株,同位素标记的ssDNA检测杂合DNA的放射性强度,参照菌株自身DNA复性的放射性强度为100%DNA-DNA杂交同源性性60%为同种70%同一亚种20～60%为同一属3、rRNA寡核苷酸编目分析rRNA是细胞中的“活化石”原核生物：23s、16s、5s真核生物：28s、18s、5.8s16s或18s用作系统分类：（提出三域学说）生理功能重要又恒定、含量高易提取、核苷酸序列保守、分子质量适中、信息量大16S、18SRNA大肠杆菌16SrRNA1542个核苷酸，T1RNA酶水解为550—600个片段6个核苷酸有22个，均匀分布工作量大4、微生物的全基因组序列测定1990年人类基因组计划1995年流感嗜血杆菌，第一全测序2010年1000种（二）细胞化学成分鉴定法1、细胞壁的化学成分肽尾的第三位氨基酸、肽尾交联2、全细胞水解液的主要糖型无糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等3、磷酸类脂成分的分析4、枝菌酸的分析5、醌类分析（三）数值分类法统计分类法，1957年英国学者P.H.A.Snerth按照微生物大量表型性状的相似形程度进行统计、归类的方法步骤一批待测菌株核有关典型菌株要求50个以上的特征，等权，越多越好计算两菌株间的相关系数按相关系数的高低排列成矩阵将矩阵图转为树状谱