第二章基因工程基本技术原理-PCR

第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程第三节PCR技术原理PCR（polymerasechainreaction）是指模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA某个特殊区域的技术.PCR是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学、基因工程和其它与DNA鉴定相关领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。返回第二章第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.1核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.2聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),其原理类似于DNA的体内复制。开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶。耐热DNA聚合酶的应用使PCR反应更易于自动化。PE-Cetus公司推出的第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR具有划时代意义，Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔化学奖第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程PCR传奇《自然》周刊1976年的《细菌学杂志》（JournalofBacteriology）：台湾钱嘉韵（AliceChang）文献耐热DNA聚合酶《科学》周刊先后拒发表《酶学方法》（MethodsofEnzymology）：吴瑞1983年春天的一个周五晚上，Mullis开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。PE-Cetus公司与MullisCetus70年代以制造维生素及抗生素为主开始转型，进入80年代以基因产品为主的研发：生长激素、胰岛素、凝血因子、干扰素、白介素等第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.3PCR原理基本原理：即DNA合成的基本原理基本要素：teplate/primer/DNApolmeraseØTemplate:ssDNAordsDNAØPrimers:oligo-nucleotides等ØSubstrates:dNTPØDNApolymerase:Taqpolymerase第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程5’amplicon3’3’5’94℃37℃72℃Cycle12分子第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程Cycle24分子Cycle38分子第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.4PCR反应过程①变性:将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；②退火:将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；③延伸:将反应体系温度调整到TaqDNA（耐热）聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程一般需使用一对引物新合成的链又可作为模板94℃4min94℃1min4℃+∞72℃10min72℃1min65℃1min变性退火延伸30循环第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.5PCR反应体系缓冲液buffer（1×）：50mMKCl引物退火10mMTris.HClpH8.3-9.01.5mMMgCl2(0.5-2.5)第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程dNTP：终浓度0.2mM(即饱和浓度)（pH7.0）4种dNTP应平衡，提高忠实性使用时应考虑Mg2+，引物，产量之间的关系如序列分析和制备探针时，用20-40mm引物：各1mm，即1pmol/mlOD260=1时:dsDNA50mg/ml（molecularcloning）ssDNA40mg/mloligo33mg/ml第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程引物与退火温度：长度至少16bp，通常20-30bpTm=81.5-16.6log[J+]+0.041(G+C)%-(600/N)N：链长J：单价离子浓度若N=20G+C%=55%[J+]=60mmol/L，则：Tm=81.5-20.3+22.6-30=53.8简单计算Tm=（G+C）×4+（A+T）×2（用于较短引物）还可从internet计算第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程Ø避免二级结构的形成Ø二聚体二级结构ØG/C和A/T分布尽管均匀，一般G+C%45-55%OligodT/oligodC除外Ø其它，如5’末端，限制酶位点的长度Ø随机引物10-12bp引物设计原则：第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程模板人基因组DNA0.1-1μg大肠杆菌基因组DNA10-100ngλDNA0.5-5ng质粒DNA0.1-10ng50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片段巢居PCR提高PCR敏感性、特异性，分析突变复合PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA锚定PCR分析具备不同末端的序列增效PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性固着PCR有利于产物的分离2.3.6PCR的相关技术第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程连接介导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCR扩增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色体基因原位PCR研究表达基因的细胞比例等臆断PCR鉴定细菌或遗传作用通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型(mapping)同时分析少量细胞的mRNA膜结合PCR去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒PCR产生合成或突变蛋白质的DNA片段第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程逆转录PCR(retrotranscriptionPCR,RTPCR)指的是以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程锚定PCR(anchoredPCR)适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，对于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程反向PCR(inversePCR,inPCR)适用于扩增已知序列的两端的未知序列。第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.7PCR技术的应用研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾等)；人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子定量第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗传学。古生物学：考古与博物馆标本分析动物学：动物传染病的诊断等植物学：检测植物病原等第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程2.3.9PCR技术未来发展的方向随着PCR技术在更多领域的越来越广泛的应用，还会有更多的新的改进问世。总之，PCR技术与每一领域的专门技术结合使用是PCR技术未来发展的方向。第二章基因工程基本技术原理—PCR西北师范大学精品课程武国凡基因工程回答问题1.什么是PCR，PCR的程序是什么？2.什么是锚定PCR，反向PCR，逆转录PCR？3.举例说明PCR的用途4.随机引物PCR和通用引物PCR有什么用途？5.实验分析题：起初，人们怀疑“非典型肺炎”是由某种人类已知病毒引起，请设计实验，用PCR的方法分析之。返回第二章