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Chapter抗病毒治疗的实验室监测盈江县人民医院杨卫华实验室检测的重要性目录(一)CD4+T淋巴细胞计数检测及结果解读(二)HIV病毒载量检测及结果解读(三)耐药检测的方法及结果解读(四)监测的时间与间隔(五)抗病毒治疗实验室检测效果评价(六)目录(一)实验室检测的重要性针对HIV疾病的检测HIV血清学抗体检测CD4计数及百分比血浆HIVRNA（病毒载量）HIV耐药检测评估抗病毒治疗及是否需要预防机会性感染HIV相关检测HLAB*5701考虑使用阿巴卡韦（Abacavir/ABC）前受体趋化性/嗜性分析考虑使用CCR5拮抗剂前其他实验室检测全血细胞计数和分类肝功能（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶）评估肝脏损伤、肝炎总蛋白/白蛋白在未治疗的HIV感染者中常见总蛋白增加，其来源为继发于B细胞增生所致的免疫球蛋白碎片；低白蛋白可能提示营养不良或肾病综合征电解质、血尿素氮/肌酐评估肾脏功能；计算GFR快速血脂和血糖尿常规提供蛋白尿，血尿证据推荐的基线相关检测合并感染及并发症相关检测合并感染及并发症相关检测CMV筛查CMVIgG抗体淋病、衣原体、梅毒筛查NAAT（nucleicacidamplificationtest）核酸扩增检测或暴露部位的培养，RPR（快速血浆反应素环状卡片试验）弓形虫感染筛查弓形虫IgG抗体结核分枝杆菌筛查TST或IGRA水痘-带状疱疹病毒筛查水痘IgG抗体病毒性肝炎筛查HBsAg,HBsAb,anti-HBc,HCVantibody,HAV或IgG抗体实验室检测对药物毒性及治疗评价非常重要只有实验室检查与临床评估相结合，才能更好地监测患者病情变化和治疗效果，从而降低HIV感染者和艾滋病患者的死亡率EVALUATION目录（二）CD4+T淋巴细胞计数检测结果解读CD4+T淋巴细胞计数检测方法流式细胞仪检测技术:目前CD4+T淋巴细胞检测的金标准非流式细胞仪检测技术:如Cyto-Spheres、Dynabeads等方法9BDFACSCalibur流式细胞仪流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,FCM）是一种可以快速、准确、客观，同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术流式细胞术的基本原理正常人、HIV、AIDS三者之间的区别AIDSHIV患者正常人CD45RA,CD3,CD4纯真T细胞生理状况和疾病对CD4+细胞计数的影响昼间变化：最低值是中午12：00左右，最高值是晚上8：30左右，还有季节变化急性感染和免疫接种：CD4+细胞计数减少药物：肾上腺皮质激素使CD4+细胞计数↓性别、年龄、妊娠、心理压力等对CD4+细胞计数影响很小一些急性感染者和大手术病人，可有中等度的减少避免在并发感染治疗后或免疫接种后4周内检测CD4+细胞绝对计数与百分比使用百分数可以减少结果的变异CD4+细胞百分数25%(儿童)定期检测CD4+T淋巴细胞数量,可判断免疫系统恢复情况,在无法得到HIV病毒载量检测结果时,以治疗后CD4+T淋巴细胞数量恢复情况作为更换二线治疗药物的标准CD4+T淋巴细胞计数的临床意义可评价HIV感染者免疫状况，辅助临床进行疾病分期是监测HIV感染病程进展、及时干预、早期转介治疗，降低死亡率的重要实验室指标可评估机会性感染的风险，判断是否预防性使用复方新诺明及复方新诺明停药时机是抗病毒治疗开始的主要指标之一我国HIV感染成人/青少年抗病毒治疗标准临床标准实验室标准处理意见WHO临床Ⅲ、Ⅳ期任何ＣＤ４+Ｔ淋巴细胞水平治疗WHO临床任何分期ＣＤ４+Ｔ淋巴细胞≤350/mm³治疗WHO临床任何分期ＣＤ４+Ｔ淋巴细胞计数在350--500/mm³之间当患者符合以下任何情况时：◆高病毒载量（＞100000拷贝/ml）◆ＣＤ４+Ｔ淋巴细胞下降较快（每年降低＞100个/mm³）◆合并活动性乙肝◆HIV相关肾脏疾病◆年龄＞65岁建议治疗，但患者必须具有治疗意愿，可保证良好的依从性WHO临床任何分期任何ＣＤ４+Ｔ淋巴细胞水平当患者符合以下任何情况时：◆TB◆HBV◆肾脏疾病◆妊娠◆单阳家庭中的HIV阳性的一方建议治疗，但患者必须具有治疗意愿，可保证良好的依从性抗病毒治疗•儿童/婴幼儿免疫学治疗标准：1.12个月的无论CD4+T淋巴细胞计数/百分比的水平多少均推荐进行抗病毒治疗。2.12—35个月的CD4+T淋巴细胞20%或者750个/mm³建议治疗。3.36—59个月的CD4+T淋巴细胞15%或者350个/mm³建议治疗。免费ART手册-1,2,3版•国家免费抗病毒治疗的指导•CD4200/mm32005年第一版•CD4200/mm32007年第二版•CD4≤350/mm32012年第三版•CD4≤500/mm32014年卫生部成本效益最大化标准化治疗国家免费ART数据库根据发展、科学证据、我国的资源不断调整预防性用药的入选标准•成人/青少年对于符合下列3个条件中任何一条的成年和青少年（≥15岁）HIV感染者，如果没有磺胺类药物过敏史，应使用复方新诺明进行预防性治疗：1.CD4T淋巴细胞200celles/mm3，或者（如果无法开展CD4T淋巴细胞检测）总淋巴细胞计数1200/mm3。2.出现WHO临床IV期的疾病或症状。3.有口腔念珠菌（假丝酵母菌）感染史。预防性用药的入选标准•儿童/婴幼儿对于符合下列3个条件中任何一条的儿童（15岁）HIV感染者应使用复方新诺明进行预防性治疗：1.所有HIV阳性母亲所生的婴儿在出生4～6周后开始服用复方新诺明，以预防PCP。并应一直服用至排除HIV感染为止（如果使用抗体检测的方法即为18个月）。2.确诊HIV感染的1～5岁儿童，CD4T淋巴细胞500celles/ul，CD4T淋巴细胞百分比15%。3.确诊HIV感染的5岁以上儿童CD4T淋巴细胞200celles/ul，CD4T淋巴细胞百分比15%。预防性用药的中止•成人及青少年抗病毒治疗后CD4T淋巴细胞计数上升到大于200cells/ul，并且维持该水平约3～6个月；•儿童抗病毒治疗3～6个月后，CD4T淋巴细胞百分比＞15％；或者抗病毒治疗6个月后临床显示免疫功能已开始重建；对以下人群应避免使用：基线CD4+T淋巴细胞≥400/mm3的男性和基线CD4+T淋巴细胞计数≥250/mm3的女性；用利福平治疗的艾滋病合并结核病患者；过去6个月使用过单剂量奈韦拉平的患者，开始新的抗病毒治疗.奈韦拉平目录（三）HIV病毒载量检测及结果解读HIV在体液内的含量精液11,000阴道液7,000血液18,000羊水4,000唾液11ml体液内平均HIV-1颗粒含量HIV病毒载量源编码CD4细胞反转录DNA集成转录翻译裂解蛋白酶HIV病毒载量是指血浆中的病毒负荷，即体内复制的病毒的数量，一般用血浆中每毫升HIVRNA的拷贝数来表示，能最直接反应体内病毒的存在状态HIV病毒载量检测方法反转录PCR技术核酸序列依赖性扩增技术实时荧光定量PCR扩增技术HIVRNA定量检测的方法•RT-PCR、EasyQ检测属于PCR方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以较容易受污染•bDNA有较好的稳定性、线性和可重复性RT-PCRbDNAECQLCx范围（50-3000000IU/ml）•结果表达方式由每毫升标本的拷贝数（cp/ml）•每毫升国际单位（IU/ml）•测定组织中的病毒载量影响病毒载量测定结果的因素血浆和血清标本•测定病毒载量应该首选血浆标本•血清的检测结果大约是血浆的50%（30-80%）用EDTA抗凝剂的采血管采集全血后分离血浆样本,其HIV－1RNA含量比ACD和肝素抗凝管中相应含量多10%～15%及20%～25%采全血后4～6小时内分离血浆,效果最佳–HIV-1在体外未处理的全血中也快速降解，全血中HIVRNA的降解速率在6小时之内平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血6-8小时以后，采血以后30小时内可能减少0.5log。–血浆样本丢失量低于全血样本。•6小时之内应分离血球和血浆•如果做不到就应该使用血浆分离管，立即离心4℃存放•需要保存30小时以上就应该放在-70℃。•PPT(Plasmapreparationtubes)管是BD公司生产的一种塑料真空管,用于采集静脉血,采血后立即离心,获得的血浆。━管内含有干粉状的K2EDTA抗凝剂和一种材料,可保证正确地离心全血后,在血浆和细胞成分之间形成一个屏障,可以在不将血浆分至另一个管的情况下运输样本温度•-70℃～室温反复冻融3次，HIVRNA变化的幅度小于0.2log•-70℃保存5个月，HIVRNA减少0.3log，-70℃保存12个月，HIVRNA减少一般不超过0.4log•血浆在室温或4℃保存3天，HIVRNA减少不超过0.5log•在样本采集现场迅速处理全血样本•分离血浆,用干冰过夜保存、2～8℃和环境正常温度三种条件运输病毒载量测定结果的分析和解释•临床稳态的病人病毒载量每日的变化大约是0.4log(2.5倍)•病毒载量的变化超过0.5log（大约是3倍）就超过了实验和每日的正常变化，应被视为有生物学意义的变化病毒载量测定结果的分析和解释•载量从50cp/ml增加到150cp/ml，虽然变化的幅度达到0.5log•可能是实验的误差病毒学失败病毒学失败：未能达到抑制病毒复制并维持HIVRNA200copies/ml病毒抑制不完全：患者在接受抗病毒治疗后24周后，连续2次血浆中HIVRNA≥200copies/ml病毒反弹：病毒曾经被完全抑制到检测下限水平以下，但因某些原因可检测到HIVRNA≥200copies/ml持续低水平病毒血症：病毒载量可以检出，但HIVRNA1000copies/ml一过性病毒血症：病毒被完全抑制后，偶尔一次可以检测到HIVRNA，但随后又回到检测下限以下，称为“blip”现象目录（四）耐药检测的方法及结果解读40临床失败恰好是冰山的最顶点病毒学失败导致免疫学失败,最终导致临床失败MurriR,etal.JAIDS.2006;41:23-30.LosinaEetal,15thCROI2008,#823临床失败免疫学失败病毒学失败40诱导耐药机理变异中可能出现对病毒有利的选择按照达尔文选择学说易于生存的准种将会取代其他病毒株药物选择压力M184V“M”是“野生型”氨基酸甲硫氨酸“184”核苷酸密码“V”突变氨基酸valine,V缬氨酸耐药的临床意义TAMs–41L,33.5%–67N,24.9%–70R,22.6%–210W,19.1%–215Y,34.7%–219Q/E,15.1%•NRTI治疗病人出现突变基因频率(Rhee)AZTLW210TYF215KQE219ML41DN67KR70416770210215219d4TM41LD67NK70RK210WT215YMK219Q/E位点药物41,67,70,210,215,219ZDV41,67,70,210,215,219d4T3TC/FTCTDFNRTI标志性突变KLysLysine赖氨酸RArgArginine精氨酸LLeuLeucme亮氨酸VValValine缬氨酸M184VK65RL74VDDI,ABCNNRTI耐药药物高度耐药部分耐药NVP存在一个突变：K101P、K103N、K103S、V106A、V106M、I132M、Y181C、Y181I、Y188C、Y188H、Y188L、G190A、G190C、G190E、G190Q、G190S、G190T、Y318W存在(A98G、L100I、K103H、K103T、V108I、F227C)中的一个突变或（K103R/V179D或V106I/V179D）的组合EFV存在一个突变：L100I、K103H、K103N、V106M、Y188L、G190C、G190Q、G190T、G190S存在（K101E、K101P、K103S、V106A、G190A、G190E、M230L）中的一个突变或K103R/V179D的组合或V106I/V179D的组