第二章生物信息的传递转录

第四章生物信息的传递——从DNA到RNADNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制●基本概念●原核生物RNA转录●真核生物RNA转录●原核生物转录产物的后加工●真核生物转录产物的后加工●真核生物转录产物中内元的去除●不连续转录和反式拼接Contents第一节基本概念在RNA聚合酶的作用下,以DNA为模板合成RNA的整个过程,包括起始,延伸,终止等步骤,叫转录。转录RNADNA转录(transcription)：参与转录的物质原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子RNA合成方向：5'3'转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。编码链与模板链与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链,又称为有义链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链，又称为反义链。GCAGTACATGTC…………5533′′′′DNACGTCATGTACAG编码链模板链GCAGUACAUGUCmRNA转录模板链并非永远在同一条单链上转录方向5335模板链编码链编码链模板链转录方向DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。结构基因：转录单元（transcriptionunit）从启动子开始至终止子结束的一段DNA序列。第二节原核生物RNA转录(RNATranscriptioninprokaryots)一、参与转录起始的关键酶与元件（一）RNA聚合酶●原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）全酶=核心酶+σ因子原核生物RNA聚合酶的发现一、原核生物的RNApolymerase(E.coli)1、全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)＋σββ’ααCoreEnzymeβααβ’σHoloEnzymeβασωαβ’图12-5E.coliRNA聚合酶的亚基组成(1)全酶（HoloEnzyme）•用于转录的起始•依靠空间结构与DNA模板结合(σ与核心酶结合后引起的构象变化)•专一性地与DNA序列(启动子)结合•结合常数：1014／mol•半衰期：数小时•转录效率低，速度缓慢（σ的结合）（2）核心酶（CoreEnzyme）•作用于转录的延伸过程（终止）•依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）•非专一性的结合（与DNA的序列无关）•结合常数：1011／mol•半衰期：60秒此外，新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能（1）σ因子•σ因子可重复使用•修饰RNApol构型•使HoloEnzyme识别启动子的SextamaBox(－35区)2α＋βα2ββ’＋σα2β＋β’α2ββ’σ（3）全酶的组装过程•不同的σ因子识别不同的启动子E.coli中有四种σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草杆菌中有11种σ因子（σ因子的更替对转录起始的调控）（2）α因子•核心酶的组建因子•促使RNApol与DNA模板链结合（3）β因子•促进RNApol＋NTPRNAelongation•完成NMP之间的磷酸酯键的连接•与Rho（ρ）因子竞争RNA3’－end（4）β’因子•参与RNA非模板链（sensestrand）的结合（充当SSB）E.coliRNApolymerase用于起始和延伸只用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶核心酶组装，启动子识别βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物无有产物较短，游离较长，与模板以氢键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无5’3’，3’5’校对合成能力无有修复能力无有（二）启动子(promoter)启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。启动子（promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）1、启动子由三个部分组成（1）Pribonow框（PribonowBox）（2）Sextama框（SextamaBox）包括识别位点和结合位点（R和B位点）（3）CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）（1）Pribonow框（PribonowBox）§-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点结合位点（B位点）§一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）因此又称TATABox保守T（2）Sextama框（SextamaBox）§-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点，§RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点—识别位点（R位点）§大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol的σ因子）§位置在不同启动子中略有变动TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT3’5’DNA转录起始点Pribnow盒子启动子3510+1转录区5’3’RNA转录起点与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基。典型启动子的结构-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp（3）CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）在缺少葡萄糖而有乳糖存在时，腺苷酸环化酶将ATP转变为环腺苷酸（cAMP），环腺苷酸（cAMP）与其受体蛋白CAP结合成复合物，这个复合物再与启动子上的CAP位点结合，然后启动子上的进入位点方能与RNA聚合酶结合。（1）起始位点（initiationsite）：＋1位点RNA聚合酶的转录起始位点起始NTP多为ATP或GTP二、转录的起始（2）起始过程：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（R位点被σ因子发现并结合）b、开放型启动子复合物的形成§RNApol的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富含A·T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡状物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合c.在开放型的启动子复合物中，RNApol的起始位点和催化位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（β亚基）形成三元复合物（DNA，RNA和RNA聚合酶）+1位多为CAT模式,位于离开保守T6~9个核苷酸处---6-9bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence（3）σ因子解离→核心酶与DNA的亲和力下降起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程转录的起始过程σ核心酶12～17bp（β亚基）（4）转录起始过程中CAP位点的作用（乳糖操纵元启动子的一部分）相关概念:＊操纵元(operon):是原核生物基因表达调控的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操作子和启动子ipozyaNolacmRNAAbsenceoflactoseActiveipozya-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresenceoflactoseInactive许多基因的表达还存在正调控机制例如:E.coli培养基中乳糖和葡萄糖共存时→只利用葡萄糖原因：CAP位点的正调控•葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将ATP→cAMP，cAMP与受体蛋白CAP在CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能与RNApol结合•葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAP－cAMP与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结合RNApol因此,一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开,结构基因才能进行转录。（对lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（1）CAP位点的组成（－70～－40）位点Ⅰ：－70～－50包括一个IR序列强结合位点位点Ⅱ：－50～－40弱结合位点位点Ⅰ对位点Ⅱ具有协同效应（cooperativity）（2）位点Ⅱ结合CAP－cAMP复合物后，促使RNApol进入SextamaBox,最终与－10序列结合起始转录原因：CAP－cAMP复合物与位点Ⅱ结合→SextamaBox富含G·C区域（G·C岛区）稳定性降低→PribnowBox的溶解温度降低→促进开放型启动子复合物的形成→促进转录（一）起始到延伸的转变★始于第一个磷酸二酯键的形成★伴随着DNA分子和酶分子构象的变化1、Prok.•起始时，σ因子有利于β和β’亚基具有与DNA专一性结合所要求的构象•起始后,σ因子解离,β和β’亚基构象发生变化三、转录延伸（二）、延伸过程（Prok）★酶与产物RNA不解离★底物NTP不断加到RNA链的3’-OH端★形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动★延伸位点不断地接受新的NTP，RNA链不断延伸☻始终保持三元复合物的结构拓扑异构酶53DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶3、转录过程中的延宕（1）RNA的合成速度大约30~50个核苷酸／秒,与蛋白质的合成速度相近（15个AA／sec）（2）模板DNA中G／C的存在延宕（G／C后的8~10个核苷酸）延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用延宕发生的原因?☆终止过程：酶停止添加底物→→释放RNA链→→酶解离☆终止子（terminator）：在转录的过程中，提供转录终止信号的RNA序列RNA序列在终止过程中起重要作用四、转录的终止AmodelfortranscriptionterminationsuggestedbystudiesonthetrpattenuatorinvitrousingbaseanalogsPeggyJ.FarnhamandTerryPlattDepartmentofMolecularBiophysicsandBiochemistryYaleUniversity,NewHaven,Connecticut06510,USAReceived22February1980.一、原核生物的终止子1、终止子的种类（1）不依赖ρ因子的终止子体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止（2）依赖ρ因子的终止子蛋白质辅助因子－－ρ因子存在时，核心酶终止转录两者有共同的结构特征（序列差异）2、不依赖ρ因子的终止子结构特征:☻一：形成一个发夹结构（茎环结构）茎：7~20bp的IR序列形成（富含G/C）环：中间不重复序列形成发夹结构的突变可阻止转录的终止☻二：6~8个连续的U串（发夹结构末端）不依赖ρ因子终止子的结构•…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNN…•…NNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN…DNA•…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN…RNA不依赖ρ终止子结构IRIR茎部富含GC不依赖ρ因子的终止子终止转录（1）新生RNA链发夹结构形成与RNApol发生作用造成高度延宕（典型的有60秒左右）（2）RNApol暂停为终止提供了机会，6~8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号RNA－DNA之间的rU－dA结合力较弱阻止RNA链的释放于是：RNA－DNA解离三元复合体解体RNApol解离转录终止（3）真正的终止点不固定，在U串中的任何一处（4）IR序列和U串同等重要IR中的G／C对含量的减少U串的缩短或缺失（5）DNA上与U串对应的为富含A／T的区域说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用3、依赖ρ因子的终止子（1）结构IR序列中的G／C对含量较少发夹结构末端没有固定特征（2）靠与ρ的共同作用而实现终止