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第二节培养基的组成、配制与灭菌一、培养基的组成和作用培养基（medium）是植物组织培养的重要材料，是外植体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养获得成功。通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。（一）矿质营养：矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。矿质元素的生理作用：（1）组成各种化合物，成为结构物质；（2）构成特殊物质，参与代谢；（3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用；（4）影响形态发生和组织、器官的建成等。根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5mmol/l的元素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中C、H、O为气体元素，其余六种为矿质元素，分别占植物干重的百分数为18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3％、0.07%、0.05％。微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。1、大量元素：组织培养中，各种矿质营养主要从培养基中获得，N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素依靠各种无机盐提供。不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同，需经试验确定。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以MS应用最广泛。以MS为例6中矿质元素分别由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2.2H2O提供。大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮的形式被使用，但铵态氮浓度过高会对有些植物培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度。而常用MS培养基中既有硝态氮又有铵态氮。2、微量元素：植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶系失活。代谢障碍等。各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高pH下，FeCl3极易形成Fe（OH）3沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。（二）有机成分：主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L,通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。（三）植物生长调节物质：植物激素是植物新称代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的用量直接影响植物细胞的分化、分裂以及发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：1、生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D2、细胞分裂类：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip3、赤霉素类：GA3、GA4、GA74、脱落酸：ABA5、乙烯：ETH1、生长素类：主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。常用的有NAA、IAA、IBA、2，4－D等。2、细胞分裂素类：促进细胞分裂和扩大，促进茎增粗，抑制茎伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰老。常用细胞分裂素有BA、KIN、ZT、2ip等。此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。如TDZ，CPPU，4－PU等。3、赤霉素类：主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破休眠等功能。常用GA3、GA4等。4、脱落酸（ABA）：促进休眠、衰老和脱落。组织培养中较少使用，主要用于调节激素平衡，促进形态建成。5、乙烯：主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。（四）碳源：碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在2-5％，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。（五）琼脂：琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90oC以上），成为凝胶，冷却后（40oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在4～10g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80％。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工工艺有关外，还受高压灭菌时的温度、时间以及pH影响。（六）有机附加物：1、椰子汁：用量为100～200g/L。2、香蕉泥：使用量为150～200g/L。3、苹果汁、番茄汁等。（七）其他成分：1、活性炭：使用量为0.2-1%。2、抗生素：常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5～20mg/L。3、抑制酚类物质形成的物质：（1）抗坏血酸：可以加入培养基或浸泡处理外植体。（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：加入培养基中。4、生长抑制剂：常用矮壮素、比久（B9）、多效唑（pp333）、三碘苯甲酸、根皮酚等。二、培养基的类型：1、高盐浓度培养基：MS、B5、SH等。适用于多数营养需求量较大的植物。2、中等盐浓度培养基：Nitsh、Miller等大量元素浓度约为MS的1/2。3、低盐培养基：WPM、White等。大量元素浓度约为MS的1/4左右。适用于木本植物的培养。表1MS培养基的组成配方组成成分数量(mg/l)组成成分数量(mg/l)NH4NO31650Na2-EDTA37.3KNO31900FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O440CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O370蔗糖30KH2PO4170pH5.8KI0.83肌醇100.0H3BO36.2烟酸0.5MnSO4·4H2O22.3盐酸吡哆醇0.5ZnSO4·7H2O8.6甘氨酸2.0Na2MoO4·2H2O0.25盐酸硫铵等0.4CoCl2·6H2O0.025表2B5培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO32500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0烟酸1.0MnSO4·4H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激动素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3表3N6培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO32.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO4·7H2O1.5三、培养基母液及激素母液的配制：由于培养基中元素种类多，用量少，因此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存，配制培养基时根据需要量取用，从而简化操作，节省时间。营养元素母液根据其性质和反应特性混合。激素母液根据使用浓度配制。1、器皿和用具的准备仪器包括万分之一天平，百分之一天平，pH计用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）滴灌、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围pH试纸、铅笔等。玻璃器皿用前清洗干净。2、药品及蒸馏水准备：药品采用分析纯或化学纯试剂。水利用蒸馏水或去离子水。3、母液配制：（1）配制母液原则：相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。（2）MS培养基母液的配制：MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe盐（100倍）、有机物（100倍）。配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母液试剂用量，然后称取药品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用万分之一天平称量。（3）激素母液的配制：根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液，用万分之一天平称取激素，溶剂溶解后加水定容。生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95％乙醇溶解；细胞分裂素类用1NHCl或1NNaOH溶解。通常激素母液浓度生长素类为0.1~0.5mg/ml,细胞分裂素母液浓度为0.2~1.0mg/ml.四、培养基的配制：1、量取母液：营养元素和激素。2、称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水的锅内，电炉上加热，使琼脂溶化。3、加入母液，混合均匀，调整pH值，定容。4、分装入瓶，每瓶40－50ml。5、封口：用4－6层称量纸封口，之后灭菌备用。五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：1、加热：灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，然后将培养基放于灭菌锅内，盖好灭菌锅盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。2、排气：当温度升至0.5kg/cm2时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。3、温度控制：当锅内压力升至1.1kg/cm2（121℃）时，计时15－20分钟，计时结束后，关闭电源。4、出锅：当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。第四节影响园艺植物组织培养的因素一、外植体：1、植物种类和基因型植物离体培养基因型的依赖性。亲缘关系相近的材料，其形态发生的条件常类似。2、材料的生理状态与发育年龄植株（无菌苗）的发育年龄，一般幼态组织比老态组织形态发生能力高。3.取材部位同一植物不同器官、组织或细胞，形态发生能力和方向常不同.eg.种子、幼胚和下胚轴常较容易形成胚状体；而茎段、叶片则比较困难。4.外植体大小对器官再生有影响.eg.木薯分生组织0.2mm,再生植株；0.2mm,愈伤组织、根5.取材季节.多数植物在生长旺盛季节、适宜环境，容易培养成功.如，温室与露地外植体。二、培养基1、营养成分一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生，不加还原氮有利于根的形成。茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往不同。碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。2.植物激素及生长调节剂（1）生长素：生长素促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。•2，4–D诱导体细胞胚胎发生，引起的细胞分裂活性促进细胞极性生长；但是，抑制体胚贮藏成分的形成，不利体胚成熟。（2）细胞分裂素：细胞分裂素促进芽的分化和形成，抑制根发育及衰老。•Eg.6–BA，噻重氮苯基（TDZ），椰子汁（3）赤霉素主要是GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。三、培养条件1、光照光照强度一般要求1000-5000lx，烟草和可可的体胚发生需高强度的光照；龙眼的体胚发生需要黑暗条件.胡萝卜的体胚也需要全黑暗的条件。•光照长度因植