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第二章微生物学经典技术•课程标准•本章要点•第一节显微技术•第二节无菌技术•第三节分离技术•第四节培养技术返回总目录课程标准了解微生物学显微技术、无菌技术、分离技术、培养技术等四大经典技术的发展历程，掌握四大经典技术所涉及的方法。一.显微技术(MicroscopicalTechnique)二.无菌技术(Aseptictechnique)三.分离技术(SeparateTechnique)四.培养技术(CultureTechnique)本章要点年12月19日星期四5第一节显微技术Microscopicaltechnique1显微镜技术的发展2光学显微镜样品的染色方法(Dyeingmethods)3电子显微镜样品的制备OpticalMicroscope,OMElectronMicroscope,EM工具是人类器官的延伸。要观察肉眼看不到的微生物，没有适当工具是不可能的。在列文虎克用显微镜揭示微小的生命世界之前80多年，已经有人制造出显微镜，并描绘了显微镜下细菌的形态。不过，看到细菌、原生动物等活的微生物，并把它们的运动记录下来的第一人是列文虎克（AnthonyVanLeeuwenhoek)。1显微镜技术的发展DevelopmentofMicroscopetechnique随着工业发展和技术进步，显微镜经过300多年的改进，现在已经是林林总总，形式多样了。但从功能上说，无非是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。器具观察对象提高放大倍数增加分辨细微结构的能力器具观察对象波束的性质操纵装置如何突显待观察的部分电磁波光波光学显微镜电子显微镜染色—0.8微米，所以光学显微镜不可能分辨小于200纳米（0.2微米）的物体。D=0.5λ/NA年12月19日星期四10目前的光学显微镜放大和分辨效率已经越来越接近其极限，大约可以将对象放大2000倍。由于一般细菌的直径大约是1微米，所以在光学显微镜下，只能观察细菌的一般形态和主要的细胞结构，即使较大的细菌，也不能有效地研究它们的内部细微结构。不仅可以看到细胞中许多细微结构，还能观察分子的形态。电磁波的波长约是0.005纳米，是可见光波长的十万分之一电子显微镜的放大倍数目前可以达到百万，可以分辨0.1—0.5纳米，也就是说，物体中相距0.1—0.5纳米的两个点也可以分辨清楚。年12月19日星期四14年12月19日星期四16后来发现细胞可以用染料染色，而且不同的细胞结构对染料有特异性反应，甚至不同种类微生物对同种染料的着色情况也不同。2染色方法DyeingMethods为了提高观察效果，被观察的对象也要进行处理。开始，微生物学家在用光学显微镜观察细菌的时候，由于悬浮在液体中的细胞既微小又透明，观察起来非常困难。染色方法的种类简单染色法（Simplestaining)复合染色法（复染法）(complexstaining)用两种或两种以上的染料对菌体或菌体的不同结构进行染色用一种染料对菌体进行染色最著名的例子是丹麦科学家革兰（Chriatian,Gram）在1884年发明的一项重要的观察细菌的方法-革兰氏染色法这种目前仍然广泛使用的革兰氏染色反应对于细菌的鉴定具有很高的价值，而且后来发现根据这个染色反应区分的革兰氏阳性细菌（能够保留染料，故细菌呈紫色）和革兰氏阴性细菌（不能保留染料而被番红花红染成红色）在许多生理特性上有区别，例如革兰氏阳性细菌对青霉素和磺胺类药物特别敏感。现在知道这是因为两类细菌的细胞壁有很大的差异。这个方法是把细菌涂在载玻片（slide)上，在酒精灯上烘干，用结晶紫染色，再用碘液处理，然后用酒精浸洗，看细胞是否能保留染料。结果发现有些细菌能保持紫色，另一些却褪色.正染色法(Positivestaining)负染色法(Negativestaining)对菌体或菌体内的结构进行染色对背景进行染色，而菌体无色年12月19日星期四21嗜酸染色法（Eosinophilicstaining）识别引起麻风的分支杆菌麻风分支杆菌年12月19日星期四23孔雀绿染细菌芽胞芽胞除了用各种染料染色样品以便清楚地观察微生物外，还可以用各种发荧光的物质来染色微生物样品。例如现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。电子显微镜观察样品的方法很多，基本上可以分为透射型和扫描型两类。前者是电子流通过观察样品而形成图象；后者则是用来观察微生物的表面细节，分辨率大约在7纳米左右。3电镜样品的制备方法用电子显微镜观察的样品需要要经过认真细致的处理以至于今天出现了一门非常有用的技术科学—电子显微镜学透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscope,TEM)的观察样品的主要制备方法：投影法在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影我们可以了解样品的立体形状、高度，通常用这种方法来观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒。年12月19日星期四28负染法。将样品的背景染色以突显样品，所以称为负染。一般是用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，例如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会投入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反应样品的内部结构。用这种方法可以观察细菌细胞、病毒等。超薄切片法这是最常用的方法，因为可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。通常是要按照一定程序对样品进行固定，脱水，然后包埋在树脂中作为支持物，用超薄切片机切成极薄的切片。因为只有在20—100纳米厚度的切片用投射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。、冰冻蚀刻法所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。年12月19日星期四322扫描电子显微镜(ScanElectronMicroscope,SEM)扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描,电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。年12月19日星期四34显微镜的问世使人类开始认识微生物，然而在对微生物的生命活动和功能有所知晓之前，微生物学并没有诞生。促使微生物学迅速诞生的，是无菌操作技术、分离技术和纯培养技术。第二节无菌技术(Aseptictechnique)1无菌技术建立的历史背景微生物是从哪里来的？在列文虎克发现微生物后，这些成了当时人们关心的问题。有些人认为是从没有生命的物质“自然发生”的，这就是古已有之的观点，叫做自然发生论(abiogenesis,autogenesis,spontaneousgeneration)。自然发生论者认为破布中会自然产生老鼠，污泥中会生出泥鳅，我国古代也有“腐草化为萤”的说法。意大利科学家斯巴兰让尼马上就指出他的实验有许多漏洞，并且证明任何一种肉汤或菜汁，在充分煮沸并且密封后，只要里面没有活的微生物，就不会腐败。一顽固的自然发生论的信徒出来辩解，他们说斯巴兰让尼在把液体煮沸并密封后，因为也把氧气赶走和隔绝了，所以微生物缺少营养而不能生长，并不是消灭了微生物本身。1749年，英国神父尼德汉发表文章，证明微生物可以自然发生。