苯并咪唑氨基甲酸酯类药物抗猪囊尾蚴的作用靶点

中国农业科学2007,40(5):1024-1032ScientiaAgriculturaSinica收稿日期：2006-03-23；接受日期：2006-12-21基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30371081）作者简介：李庆章（1953-），男，河北清苑人，教授，博士，博士生导师，研究方向为生物化学与子生物学。Tel：[phone]；Fax：[phone]；E-mail：[e-mail]苯并咪唑氨基甲酸酯类药物抗猪囊尾蚴的作用靶点李庆章，郝艳红，高学军，刘永杰，高文学，赵冰（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：【目的】研究苯并咪唑氨基甲酸酯类抗囊药物对猪带绦虫囊尾蚴的作用靶点，为药物的类型衍化和新药开发提供理论依据。【方法】测定体外培养的和猪体内的囊尾蚴于阿苯哒唑和奥芬哒唑分别作用后能量代谢途径物质含量及其关键酶活性变化。【结果】阿苯哒唑和奥芬哒唑对体外培养猪六钩蚴、未成熟期和成熟期猪囊尾蚴，以及体内发育未成熟期和成熟期猪囊尾蚴的糖无氧分解途径、丙酮酸羧化支路与逆向三羧酸循环途径均有一定程度抑制作用，代偿性促进糖异生及蛋白质、脂类和核酸分解途径，葡萄糖吸收受阻。阿苯哒唑和奥芬哒唑体外非竞争性抑制延胡索酸还原酶复合体活性。【结论】并咪唑氨基甲酸酯类抗囊药物非竞争性抑制猪囊尾蚴FR复合体活性，抑制葡萄糖的摄取。关键词：阿苯哒唑；奥芬哒唑；猪囊尾蚴；作用靶点；能量代谢TheTargetofBenzimidazoleCcarbamateAgainstCysticercicellulosaeLIQing-zhang，HAOYan-hong，GAOXue-jun，LIUYong-jie，GAOWen-xue，ZHAOBing（CollegeofBiologicalScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030）Abstract:【Objective】TheobjectivewastostudythetargetofbenzimidazolecarbamatedrugsagainstCysticercicellulosaeandgivetheoreticalbasisfortypeevolutionandnewdrugdesign.【Method】ChangesofkeyenzymeactivitiesandmetabolitecontentsinpathwayofenergymetabolisminCysticercicellulosaeinvitroandinvivoweretestedwithalbendazoleandoxfendazolerespectively.【Results】Albendazoleandoxfendazolebothinhibitedthepathwaysofanaerobicglycolysis,partialinversedtricarboxylicacidcycleofTaeniaSoliumoncosphere,immatureandmaturecysticerciinvitroandimmatureandmaturecysticerciinvivoincertaindegree.Theyenhanceddecomposinginfat,aminoacid,andxanthinemetabolism.Ontheotherhand,absorptionofglucosewashindered.Albendazoleandoxfendazolebothinhibitedtheactivitiesoffumaricreductasecomplexnoncompetentlyinvitorespectively.【Conclusion】Benzimidazolecarbamatedrugscaninhibittheactivitiesoffumaricreductasecomplexnoncompetentlyandhindertheabsorptionofglucose.Keywords:Albendazole;Oxfendazole;Cysticercicellulosae;Target;Energymetabolism0引言【研究意义】苯并咪唑氨基甲酸酯类（benzimidazolcarbamate）药物是一类近年来发展非常迅速的抗寄生虫防治药，是许多寄生蠕虫疾病治疗的首选药物[1,2]。苯并咪唑类化合物包括一组广谱抗蠕虫药物，第一代药物如噻苯达唑，因毒性太大，已被淘汰，目前应用的主要是甲苯达唑和阿苯达唑。甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑等苯并咪唑类抗蠕虫药物均已作为广谱抗蠕虫药物应用于寄生虫的治疗，取得了很好的效果，但这些药物都有着这样或那样的缺点或不足，制约着其临床的应用，因而研究苯并咪唑类抗蠕虫药物的作用机理，开发更高效或特异的药物成为寄生蠕虫疾病治疗的需要[3,4]。【前人研究进展】传统看法认为苯并咪唑氨基甲酸酯类抗蠕虫药物的基本作用机理为多种作用，如噻苯达唑和阿苯达唑可抑制线虫的延胡索酸还原酶；噻苯达唑还抑制缩小膜壳绦虫和肝片形吸虫的延胡索酸还原5期李庆章等：苯并咪唑氨基甲酸酯类药物抗猪囊尾蚴的作用靶点1025酶，在人蛔虫延胡索酸还原酶被苯硫咪唑抑制的部位看来是在深红醌被黄素蛋白1还原的水平上，在琥珀酸脱氢酶和终末氧化酶之间可能有第二个抑制部位。高浓度的苯并咪唑类是氧化磷酸化的解偶联剂，在肝片形吸虫和扩展莫尼茨绦虫，甲苯咪唑和丙噻咪唑（cambendazole）可引起ATP水平的下降。从苯并咪唑的结构来看，它们可能是起嘌呤类似物的作用。甲苯咪唑可抑制线虫、某些吸虫和绦虫对葡萄糖的摄取。近已证明苯并咪唑与微管蛋白结合从而阻止微管形成[5,6]。苯并咪唑类抗蠕虫药物阻止微管形成和抑制蠕虫的延胡索酸还原酶似乎是矛盾的，学术界对苯并咪唑类抗蠕虫药物的作用机理也有上述两种不同的提法。McCracken认为苯并咪唑类抗蠕虫药物的本质作用机制是抑制蠕虫线粒体的电子传递体系和与电子传递体系偶联的磷酸化反应，而与微管形成有关的葡萄糖转运系统受阻则是ATP合成反应受抑制的结果[7,8]。【本研究的切入点】苯并咪唑类抗蠕虫药物具有基本的显效结构，此类药物的作用机理基本相同，但关于这类药物的作用机理还需要进一步研究才能证实。真正阐明此类药物的作用机理，对此类药物的类型衍化和新药设计具有重要的意义。【拟解决的关键问题】猪囊尾蚴病（Cysticercosiscellulosae）至今在世界各地发展中国家仍严重危害着人民的健康甚至危害生命[9~12]。人患猪囊尾蚴病后，尚无有效的药物治疗，主要原因是尚缺乏有效杀灭未成熟期猪囊尾蚴的药物。因而研究阿苯哒唑和奥芬哒唑等药物对猪囊尾蚴能量代谢的影响，将为研究此类药物的作用机理和筛选抗囊新药提供快捷和有效的试验方法[13]。1材料与方法1.1试验材料猪六钩蚴由黑龙江省驱绦灭囊办公室、哈尔滨医科大学寄生虫教研室和吉林农业大学囊虫病研究所提供；猪囊尾蚴人工成功感染长白与哈白杂交家猪（东北农业大学实验基地，2002）后分期获得；试验药物阿苯哒唑（albendazole，ALB）和奥芬哒唑（oxfendazole，OXF），由中国农业科学院上海寄生虫病研究所猪带绦虫囊尾蚴病研究室提供。1.2猪六钩蚴的体外培养及药物作用靶点的确定与药效机理研究剪碎绦虫节片取出猪六钩蚴作脱壳处理后，置于不同培养液中在培养箱中培养。对照组（C组）用PRMI1640完全培养液，ALB组用含400μg·ml-1ALB的PRMI1640完全培养液，OXF组用含400μg·ml-1OXF的PRMI1640完全培养液。以上各组分别在24h、72h取一定量虫卵备测，每个测定5个重复（下同）[14]。1.3猪囊尾蚴的体外培养及药物作用靶点的确定与药效机理研究[15,16]（1）未成熟期猪囊尾蚴的体外培养及药物作用靶点与药效机理将感染后30日患囊尾蚴病的猪屠宰，从肌肉中取出猪囊尾蚴，置于孵育液中，37℃孵育至头节伸出，取出后置于无菌生理盐水中洗涤4～5次，取外形相似、大小相同的猪囊尾蚴120个，随机分为3组（每组40个），分组及处理同上。（2）成熟期猪囊尾蚴的体外培养及药物作用靶点与药效机理感染后80日的猪囊尾蚴300个，分成4组（每组100个），进行体外培养，方法同1.2。在培养12、24、36、48h后，各组分别取出20个猪囊尾蚴备测。1.4猪囊尾蚴的体内发育及药物作用靶点的确定与药效机理研究[17~20]（1）未成熟期猪囊尾蚴的体内发育及药物作用靶点与药效机理选无猪囊尾蚴感染的子猪26头，人工感染猪带绦虫卵后，于不同时期检测抗猪囊尾蚴抗体效价。当抗体效价达到1﹕16以上时，开始用药。每个用药组设6头猪，感染后不用药组5头，未感染也未用药组3头。C组不用任何药物；ALB组，取ALB按100mg·kg-1分3次口服；OXF组，取OXF按30mg·kg-1一次口服。以上各组分别在用药后24、48、72、120h屠宰，取猪囊尾蚴备测。（2）成熟期猪囊尾蚴的体内发育及药物作用靶点与药效机理选无猪囊尾蚴感染的子猪28头，人工感染猪带绦虫卵后，间断屠宰判断猪囊尾蚴成熟率。当猪囊尾蚴成熟率达到80%以上后开始用药。每个用药组设6头猪，感染后不用药组5头，未感染也未用药组5头。用药方法同1.4（1），以上各组分别在用药后24、48、120、240h屠宰，取猪囊尾蚴备测。1.5抗囊药物对猪囊尾蚴延胡索酸还原酶活性的影响分别测定不同浓度阿苯哒唑和奥芬哒唑对猪囊尾蚴匀浆延胡索酸还原酶（FR）活性的抑制作用。在不同浓度底物延胡索酸溶液中，分别测定一定浓度阿苯哒唑和奥芬哒唑抑制猪囊尾蚴组织匀浆FR的动力学数据。1.6数据处理采用美国SAS软件公司出版的SAS统计软件进行1026中国农业科学40卷差异显著性检验。试验结果各表中大写字母不同为差异极显著（P0.01）,小写字母不同为差异显著（P0.05），小写字母相同为差异不显著（P0.05）。2结果与分析2.1药物对猪六钩蚴能量代谢的影响药物对体外培养猪六钩蚴能量代谢有关酶活性和代谢物含量的变化见表1。ALB和OXF作用于体外培养猪六钩蚴72h丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷丙转氨酶（GPT）活性显著降低、葡萄糖（GLc）含量显著降低、乳酸（LAC）含量和尿酸（UN）含量呈现明显升高。2.2药物对猪囊尾蚴能量代谢的影响2.2.1药物对体外培养猪囊尾蚴能量代谢的影响（1）药物对体外培养未成熟期猪囊尾蚴能量代谢的影响药物对体外培养未成熟期猪囊尾蚴能量代谢表1药物对体外培养猪六钩蚴能量代谢酶活性和物质含量变化的影响Table1Changesofenzymeactivitiesandmetabolitecontentsofenergymetabolisminimmatureoncosphereinvitrowithdrugs指标Indexes组别Groups时间Time（h）指标Indexes组别Groups时间Time（h）24722472GLc(mmol/mgprot)CALBOXF2.86±0.24a2.83±0.27AGPT(IU/mgprot)CALBOXF0.22±0.02a0.28±0.02a1.76±0.16b0.98±0.07Ba0.19±0.01a0.11±0.01b1.81±0.13b1.06±0.09Ba0.26±0.03a0.13±0.01bPK(U/mgprot)CALBOXF5.58±0.42a5.23±0.39aGDH(U/mgprot)CALBOXF6.64±0.49a6.33±0.47a4.89±0.33a3.72±0.21b6.52±0.46a5.88±0.44a5.15±0.44a3.06±0.24b7.21±0.55a7.55±0.58aLDH(U/mgprot)CALBOXF