第二章高效液相色谱法.

第二章高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatographyHPLC）目的要求：1.熟悉HPLC法的基本原理和测试技术。2.掌握HPLC法色谱条件选择、定性定量分析方法。3.了解HPLC法在中药研究中的应用。主要参考书：第一节绪论高效液相色谱法：二十世纪六十年代末期，在经典液相色谱的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵、高效固定相，以及高灵敏度检测器发展而成的分离分析方法。HPLC和经典LC的主要区别为固定相、输液设备和检测手段的差别；和GC的主要差别为分析对象和流动相的差别，和GC相同之处在于都具有分离和分析的功能，可以在线检测。一、HPLC与经典LC区别1．经典LC：只能做为一种分离手段。常压或低压下输送流动相固定相颗粒粗，粒径100μm，且不均匀，柱内径1～3cm，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱效低（H↑，n↓），色谱柱不能连续使用分析周期长无法在线检测样品用量大，灵敏度低2．HPLC：既可分离又可分析手段高压输送流动相固定相粒度小且均匀，粒径10μm（全多孔球形微粒，匀浆装柱），柱内径2～6mm，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效高（H↓，n↑），色谱柱可反复使用分析周期短可以在线检测灵敏度高，如UVD的最小测定量可达10－9g，FD的灵敏度可达10－11g二、HPLC与GC差别1．分析对象GC：主要用于挥发性、热稳定性好、且沸点较低的物质的分析，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型、高分子化合物及生物活性物质不可检测。只能分析占有机物总数20%的物质。HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，能分析占有机物总数80%的物质。2．流动相差别GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。且载气种类少，性质接近，改变载气对柱效和分离效率影响小。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。流动相种类较多，可供选择范围广，流动相极性和pH值的选择，是控制柱效和分离效率的重要因素之一，选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性。3.固定相差别GC：多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍液体的固定相，且粒度粗。HPLC：大都是新型的固体吸附剂、化学键合相等，粒度小（一般1.7～10μm）。4．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、HPLC的特点和应用“三高”“一快”“一广”高柱效（n=104片/米，远高于LC），高灵敏度，高选择性，分析速度快，应用范围广泛，可以分析80%以上的有机化合物，如生命科学、生物工程，环境科学、中医中药及现代医学等领域的基础研究和应用工作中，都离不开各种类型的HPLC色谱仪。另外，流出组分容易收集，操作可以自动化，使用安全，亦可用于样品的纯化制备（制备型HPLC仪）。四、HPLC法的局限性流动相用的多种溶剂，较GC法成本高易引起环境污染梯度洗脱比GC法的程序升温操作复杂不能分析高压下易分解、变性的具有活性的生化样品第二节高效液相色谱仪近年来，高效液相色谱技术得到迅速的发展，如美国的Waters、P-E、SP、Agilent（HP）、Thermo、贝克曼，日本的岛津、日立，法国的吉尔森等公司都大量地推出自己的产品，更新换代非常迅速，基本原理和色谱流程都是相同的，仍然由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、馏分收集及数据记录与处理系统组成。六通法进样器岛津Lc-2010HTHPLC仪Agilent1100型HPLC仪一、输液系统：（一）流动相贮器，又称贮液瓶要求：贮液瓶所用的材料对大多数有机化合物呈化学惰性，应耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，有无色和棕色，棕色的用于流动相需闭光的。输出流动相的连接管路，其插入贮液瓶的一端，要连有孔径为0.45μm的多孔不锈钢过滤器或由玻璃制成的专用膜过滤器。在线真空脱气装置（二）脱气装置作用：排除气泡，减小基线噪音、不影响检测和不破坏色谱柱。常见的脱气方法有：1．超声波振荡脱气法：10～30min/500ml，不影响组成各种溶剂常用2．抽真空脱气法：真空泵单一溶剂常用（同时完成过滤和脱气双重任务）3．加热回流脱气法：电化学检测器单一溶剂4．吹氦脱气法：吹入氦气，使流动相中溶解的空气排除，成本高，不实用5．在线真空脱气法：在线脱气，脱气效果优于前几种方法，适用于多元溶剂体系。（三）输液泵作用：把样品带入到色谱柱中，使样品在固定相和和流动相之间作用来实现分离。恒压泵－－流量精度不稳恒流泵－－常用，柱塞往复泵柱塞往复泵：输液的脉冲性较大。双泵补偿法：由两个柱塞往复泵串联或并联，两个泵的柱塞运动方向相反，克服了输液的脉冲性，使流速稳定。输液泵必须具备以下功能和性能：1.耐高压:平均粒径3～5μm，内径3～5mm的色谱柱，流动相流速1～3mL/min，最高工作压力达到34.47～41.36MPa。对于1～2.5μm的小粒径无孔色谱的应用，耐受压力的要求更高。2.输液平稳脉动小：平稳连续的输液，脉动比较小，才能够保证分离的重复性。3.流量范围宽，且连续可调常规分析要求的流量范围一般为0.010～10mL/min，甚至到0.001mL/min。制备分离要求流量范围从1～几百甚至几千mL/min。宽流量范围的流量准确性和稳定性对于进行梯度分离很重要。4.流量重复性好直接影响到样品保留时间的重复性，是衡量输液泵最重要的指标。5.流量准确度高只有设定的流量和实际值的差值很小，才能够保证试验方法的互换性和可移植性。6.溶剂置换容易，系统死体积小具有大流量快速溶剂置换功能，能够保证快速置换溶剂并将系统气泡赶出。7.具有压力检测与保护功能要求输液泵要具有压力检测与显示、过压和低压泄漏保护功能，保证系统正常运行和仪器使用安全。8.能进行时间流速的程序控制能够自动设定时间流速程序，定时开关机。9.耐腐蚀性好，惰性生物样品，常用腐蚀性较大的缓冲液，对泵的耐腐蚀性要求很高。10.具有梯度洗脱功能11.联用功能与系统可扩展性:易于实现色谱工作站系统控制，实现流速、压力、温度及梯度程序等外部设定，方便自动进样器等联用。12.维护方便更换柱塞杆和密封圈方便容易具有柱塞杆清洗功能，避免盐、缓冲液等在柱塞杆上沉积引起的磨损。（四）梯度洗脱装置梯度洗脱，又叫溶剂程序，是采用两种或多种不同洗脱能力的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相的浓度比例和极性的一种洗脱方式。梯度洗脱技术能够提高分离度，缩短分析时间，改善峰形，降低最小检测量并提高分析精度。对于复杂混合物，特别是保留性能相差较大混合物的分离，梯度洗脱是一种极为重要的手段。梯度洗脱分高压和低压梯度两种洗脱装置：高压梯度洗脱装置：两个输液泵分别各吸一种溶剂增压后→梯度混合室→色谱柱，混合比例由两个泵的速度决定。低压梯度洗脱装置：常压下用比例阀将多种溶剂按比例混合→泵增压→色谱柱。目前多采用低压梯度洗脱装置，易实现多元梯度洗脱，且便宜。影响梯度洗脱的因素：①溶剂的纯度要高，否则会使梯度洗脱的重现性变坏。②梯度混合的溶剂互溶性要好，应防止不互溶的溶剂进入色谱柱。还要注意溶剂的黏度和相对密度对混合流动相组成的影响。③梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如UVD、FD），不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如折光指数检测器）。④进行下一次梯度洗脱之前，起始流动相的平衡时间，至少15-20倍柱体积。二、进样系统作用：是将样品引入色谱柱中进行分离和分析。进样前，样品溶液必须用0.45μm微孔滤膜过滤。常用的进样器装置：六通阀进样装置六通阀进样原理（a）采样位置（b）进柱位置进样后，转动六通阀，定量管内的样品被流动相带入色谱柱。六通进样阀具有进样量准确、重复性好，可带压进样特点。缺点是有一定的死体积，会引起峰形变宽。自动进样装置：是采用微处理机来控制进样阀采样（通过阀针）、进样和清洗等操作。三、色谱分离系统：分离系统性能的好坏是色谱分析的关键，包括保护柱、色谱柱、恒温装置等。（一）保护柱：作用：保护分析柱，用来挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒。保护柱与分析柱是同种填料，但粒度比分析柱大。（二）色谱柱：由内部抛光的不锈钢柱管或塑料柱管和固定相组成，是HPLC仪的重要部件，分离的核心，要求能承受高压，对流动相呈化学惰性。其结构如图所示：色谱柱在装填料之前是没有方向性的，但填充完毕的色谱柱是有方向的，即流动相的方向应与柱的填充方向（装柱时填充液的流向）一致。色谱柱的管外都以箭头显著地标示了该柱的使用方向（而不像气相色谱那样，色谱柱两头标明接检测器或进样器），安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。要求：柱效高、选择性好、分析速度快。按照其分离模式按照分离规模按照柱中流动相的流向不同正相柱反相柱离子交换等分析型柱：内径2～4.6mm，柱长10～25cm。应用最广泛。制备型柱：内径20～40mm，柱长10～30cm。微型柱：内径1～1.5mm，柱长5～10cm。纵向柱，通常在无特殊说明情况下所说的色谱柱都是纵向柱。径向柱锥形柱制备用色谱柱的评价：一支色谱柱的好坏要用一定的指标来进行评价。一个合格的色谱柱评价报告应给出色谱柱的基本参数，如柱长内径、填充载体的种类、粒度、柱效等。柱效评价是在液相色谱仪器系统的死体积应尽可能小，采用的样品及操作条件应当合理的条件下，评价色谱柱的样品可以完全分离并有适当的保留时间。下表列出了评价各种液相色谱柱的样品及操作条件。表评价各种液相色谱柱柱效的样品及操作条件色谱柱的稳定性和使用寿命取决于我们操作者对色谱柱的使用和维护，它与注入样品的类型也有很大关系，在使用过程中，会由于各种原因导致分离的失败或色谱柱失效。常见的问题有：进口筛板堵塞→压力↑，色谱峰拖尾，n↓（反冲）柱床断层→色谱峰拖尾，n↓吸附样品杂质→n↓，选择性变差，tR↓（再生）固定相化学破坏→色谱峰拖尾，n↓，选择性变差，tR↓色谱柱的平衡与保护：使用新的色谱柱首先要平衡一定时间才能开始分析样品。反相柱平衡方法：以甲醇或乙腈作为流动相，首先以低流速0.2ml/min将色谱柱平衡过夜（关检测器！），然后缓慢地增加到0.8ml/min冲洗30min，至柱中固定相充分平衡至最佳状态，再换分析流动相，至少要10倍柱体积后开检测器直到获得稳定的基线，进行样品测定。如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，应注意首先用20倍柱体积的5-10%乙腈（或甲醇）-水流动相“过渡”，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。正相柱（氨基或氰基柱）平衡方法：首先阅读柱子测试报告书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂（一般是用正庚烷保存），与将要使用的流动相极性不同，不互溶，请先用异丙醇过渡，应注意因为异丙醇粘度较大，会导致柱压很高，所以要适当调低流速(0.5mL/min以下，且缓慢提高流速)。以下按反相柱的平衡方法平衡，同样要注意流动相中还含有缓冲盐类的“过渡”问题。色谱柱使用过程中应避免突然变化的高压冲击，流动相的pH值应保持在2.5-7之间。每2-3月需维护。色谱柱的冲洗：每次测定完样品后，要用不同极性的流动相梯度冲洗干净柱子，最后以有机相保存在柱子里。（一般不少于10倍柱体积冲洗，如果流动相是缓冲液，冲洗的时间会更长）色谱柱的再生：当色谱柱柱性能降低时，需要对色谱柱进行再生，在再生前后分别测定柱效能和容量因子，比较色谱柱的性能改善情况。反相色谱柱再生：一般为依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90（V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱，最后用甲醇，再测柱效。正相色谱柱再生：一般为依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱，再测柱效。应注意溶剂必需严格脱水。（三）柱恒温箱：柱温是液相色谱的重要参数。作用