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——端粒与端粒酶主讲人：杨长友重庆师范大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业长寿梦想的“天梯”2009年诺贝尔生理学或医学奖贡献：揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”(染色体是如何被端粒和端粒酶保护的)。ElizabethH.Blackburn伊丽莎白·布莱克本CarolW.Greider卡罗尔·格雷德美国巴尔的摩约翰·霍普金斯医学院JackW.Szostak杰克·绍斯塔克美国哈佛医学院美国加利福尼亚旧金山大学主要内容端粒与端粒酶的发现端粒的结构与功能端粒酶的结构与功能端粒及端粒酶与衰老、癌症的关系端粒与端粒酶的研究现状影响端粒长度的因素一、端粒与端粒酶的发现•端粒最早是由著名的遗传学家赫尔曼·缪勒（HermannMuller，因为发明用X射线突变基因而获得1946年的诺贝尔生理或医学奖）于1938年发现的。•缪勒给这种天然末端结构取了个形象的名字——telomere，这是由希腊语“telos”(末端)及“meros”(部分)组成的。中文翻译为“末端的颗粒”，简称“端粒”。•1941年芭芭拉·麦克林托克（BarbaraMcClintock，因为发现玉米的转座子获得1983年诺贝尔生理或医学奖）在玉米的遗传学研究中也证实端粒的存在。端粒的位置一、端粒与端粒酶的发现•1978年伊丽莎白通过体外DNA复制实验，推断出模式生物四膜虫（Tetrahymenathermophila）的端粒中含有许多重复的5’-CCCCAA-3’六碱基序列，首次阐明了四膜虫的端粒结构。同时，杰克·绍斯塔克正试图在酵母中建构人工线性染色体，希望它能够像自然染色体一样在细胞中复制。但他构建的人工染色体转化入细胞后总是很快降解。•1980年，当伊丽莎白报道她关于端粒DNA的发现时，引起了杰克的极大兴趣。于是二人合作将新发现的四膜虫端粒序列和人工染色体连接到一起，而后导入酵母细胞。奇迹出现了，人工染色体不再降解，可以在细胞内正常复制。这一方面证实了端粒对染色体的保护作用，也使DNA的大片段克隆成为可能，为后来的人类基因组测序奠定了基础。一、端粒与端粒酶的发现1984年，伊丽莎白在试验中发现了一个有趣的现象：不论是四膜虫还是酵母自身的端粒序列都可以在酵母中被保护和延伸。而带着四膜虫端粒DNA的人工染色体进入到酵母后，复制后被加上的是酵母端粒序列而非四膜虫的端粒序列。一、端粒与端粒酶的发现一、端粒与端粒酶的发现1984年，卡罗尔作为博士研究生进入伊丽莎白实验室，开始了端粒末端合成机制的研究工作。她们假设端粒是由某种酶合成，那么在细胞裂解液里应该有这种酶的存在，如果使用四膜虫细胞裂解液在体外能检测到端粒序列的复制和延伸，那无疑证实这种“酶”的存在。一、端粒与端粒酶的发现实验过程大致如下：1、将底物寡聚核苷酸（端粒DNA、随机序列DNA）进行放射性标记；2、将高浓度的寡聚核苷酸底物与高浓度的四膜虫细胞裂解液一起孵育；3、通过放射性标记的核苷酸来检测体外端粒序列的合成。一、端粒与端粒酶的发现结果显示，当四膜虫细胞裂解液加入四膜虫或酵母端粒序列DNA时，其明显被重新加上了DNA碱基，而且以6个碱基递增的方式延长，与四膜虫端粒重复基本单位为6个碱基正好吻合，而对于随机序列的DNA底物并不发生延伸。实验结果证明，端粒DNA的延伸是通过“酶”来完成的，且这种酶的活性不依赖于DNA模板。这种酶后来被命名为“端粒酶”（telomerase）。一、端粒与端粒酶的发现1985年，卡罗尔和伊丽莎白在四膜虫细胞核提取物中首先发现并纯化了端粒酶。之后，耶鲁大学Morin于1989年在人宫颈癌细胞中也发现了人体端粒酶。二、端粒的结构与功能•端粒(telomere)也称端区，是真核生物线性染色体的天然两末端，呈膨大粒状，由染色体末端DNA重复片断（富含G、C）与蛋白质组成（端粒结合蛋白和端粒相关蛋白）。•端粒既有高度的保守性，又有种属特异性。哺乳动物端粒的重复序列为(TTAGGG／AATCCC)，其中G链3’端是一段单链的悬突(overhang)。电镜观察发现，端粒结构是一个双环结构，由T环(T-loop，端粒环)和D环(D-loop，替代环)构成，T环在染色体末端形成一个帽子结构，可防止核酶以及连接酶作用于端粒。同时，T环结构在端粒长度的维持机制中起重要作用。端粒及其基本结构二、端粒的结构与功能•端粒的主要功能①保护染色体末端免遭融合、重组，防止染色体在细胞内被化学修饰或被核酶降解；维持染色体的完整性。②阻止细胞对染色体末端的DNA损伤反应。③为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。④决定细胞的寿命。当端粒再也无法保护染色体免受伤害时，细胞就会停止分裂，或者变得不稳定。因此，生物体细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度也就决定了细胞的寿命，所以端粒又被称为“生命的时钟”。三、端粒酶的结构与功能端粒酶(又称端粒体酶)是由端粒酶RNA组分和蛋白质组分共同构成的核糖核蛋白复合物，这个酶复合物中的RNA是模板，其上含有引物特异识别位点，而蛋白质成分则具有催化活性。三、端粒酶的结构与功能目前认为端粒酶主要由3个部分构成，即端粒酶RNA(telomeraseRNA，TR)、端粒酶相关蛋白质(telomerase—associatedprotein，TP1/TP2)和端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)。其中，TERT是端粒酶的催化亚基，也是决定端粒酶活性的关键因素，其表达水平的高低与端粒酶活性呈平行关系。研究发现，TR和TP1在正常组织中有广泛表达，而TERT只在肿瘤组织及某些高增殖组织中表达，并决定着这些组织的端粒酶活性；正常组织缺乏TERT表达，因而没有端粒酶活性。三、端粒酶的结构与功能•端粒酶的重要功能是通过识别并结合富含胞嘧啶C的端粒末端，以自身RNA为模板合成端粒的DNA重复序列，从而阻止随着DNA复制和细胞分裂所造成的端粒的不断缩短，进而稳定染色体的长度，避免细胞因端粒丢失所导致的凋亡。因此，端粒酶在细胞永生化和肿瘤发生中起着重要作用。三、端粒酶的结构与功能近年来有证据表明，端粒酶除有端粒保护作用外，还有促进细胞生存和抵抗应激的非端粒保护作用，主要表现为保护线粒体功能、调节细胞Ca2+内流、参与细胞因子调节、参与细胞信号转导及相关基因表达。四、端粒及端粒酶与衰老、癌症的关系目前认为，细胞的衰老是由于端粒的丢失引起的，而端粒的丢失又与端粒酶的活性有关。人类细胞内端粒酶活性的缺失导致了端粒缩短，每次丢失50～200个碱基，这种缩短使得端粒最终不能被细胞识别。端粒一旦短于“关键长度”，就很有可能导致染色体双链的断裂，并激活细胞自身的检验系统，从而使细胞进入M1期死亡状态。当几千个碱基的端粒DNA丢失后，细胞就会停止分裂而进入衰老状态。四、端粒及端粒酶与衰老、癌症的关系如果细胞被病毒感染，或者某些抑癌基因如p53等的突变，细胞可越过M1期而继续分裂，端粒继续缩短，最终达到一个关键阈值，细胞进入第二致死期M2，这时染色体可能出现形态异常，大多数细胞由于端粒太短而失去功能，从而导致细胞死亡。但极少数细胞能在此阶段进一步激活端粒酶，使端粒功能得以恢复，并维持染色体的稳定性，从而避免死亡，导致细胞永生化甚至癌变。Fig.Telomere,telomeraseandcellularlifespan五、端粒与端粒酶的研究现状端粒维持机制研究1、端粒酶机制端粒酶在生殖细胞、早期胚胎发育、干细胞和许多癌症细胞中有很高的活性。而在人的正常体细胞中，由于端粒酶活性很低或处于无法检测的水平，端粒的缩短无法得到弥补，最终会产生细胞融合导致细胞死亡。五、端粒与端粒酶的研究现状2、端粒延伸替代机制（alternativelengtheningoftelomeres，ALT）目前关于ALT的分子机理还没有完全弄清楚，它有可能是通过滚环复制、T-loop介导延伸和端粒重复片段之间的同源重组机制来延长端粒的长度。五、端粒与端粒酶的研究现状克隆动物端粒长度的研究体细胞核移植作为一种有效的无性生殖手段，在基础研究、组织再生和挽救濒危动物方面有着巨大的应用力，因此越来越多的受到人们的关注。目前，在克隆动物端粒长度的研究中，研究者们比较感兴趣的问题主要有：1、体细胞核移植生产的克隆动物分娩常会出现各种缺陷，这是否与端粒长度变化造成发育畸形、衰老和疾病有关？2、克隆动物的端粒在重构胚(胚胎早期)是否或如何被修复；3、端粒长度是否会恢复到正常。五、端粒与端粒酶的研究现状•端粒酶逆转衰老过程的研究2010年11月，美国哈佛大学医学院的研究者JaskelioffM等在Nature杂志发表了有关端粒酶和衰老研究的重要发现。他们利用基因工程技术成功地将端粒酶缺陷型小鼠的衰老过程逆转。迄今为止，这是首次有小鼠动物实验成功地逆转衰老过程，意味着一些老化的器官也有“重生”的可能。这项突破成果或有望防治脑退化症（如老年痴呆症）、糖尿病和心脏病等疾病，甚至有望打开永恒青春的奥秘。五、端粒与端粒酶的研究现状端粒酶抑制剂研究1、核苷类逆转录酶抑制剂(ddG和AZT等)抑制机制：竞争性抑制作用五、端粒与端粒酶的研究现状2、非核苷类小分子抑制剂这类小分子主要是与端粒酶的催化亚基端粒酶逆转录酶TERT相互作用，如MKT077和BIBR1532。五、端粒与端粒酶的研究现状3、寡核苷酸类端粒酶抑制剂寡核苷酸类药物主要是利用反义技术对TR进行抑制。如GRN163及其类似物GRN163L。此类药物用于肿瘤治疗有两个问题需要解决：吸收度差及体内稳定性差。五、端粒与端粒酶的研究现状G-四联体是由若干个平面G四分体结构堆积而成的。右图是由四个鸟嘌呤通过氢键作用连接而成的G四分体结构。4、G-四联体稳定剂(G-QuadruplexStabilizers)五、端粒与端粒酶的研究现状G-四联体的形成使得端粒酶不能与端粒很好的结合，也就失去了其延长端粒的作用。而且这类药物不仅能作用于端粒酶阳性的细胞，而且对ALT细胞也能产生作用。因此，设计一种能够促进G-四联体的形成或者稳定G-四联体结构的化合物，将是肿瘤治疗研究的方向之一。这类药物的主要问题是安全性：活性的G-四联体稳定剂可以影响正常细胞的端粒结构以及基因组中富含鸟嘌呤G的区域的稳定性。五、端粒与端粒酶的研究现状端粒检测TelomeHealth公司由端粒研究先驱卡尔文·B·哈利（CalvinB.Harley）与伊丽莎白·布莱克本(ElizabethH.Blackburn)于2010年1月共同创立。LifeLength公司由西班牙国立研究中心端粒与端粒酶研究的负责人玛利亚·A·布拉斯科（MariaA.Blasco）在2010年9月创立。五、端粒与端粒酶的研究现状五、端粒与端粒酶的研究现状•万能癌症疫苗的研究2011年4月15日，据英国《每日邮报》报道，英国科学家近期研制出了一种“万能”疫苗，可用于治疗包括胰腺癌在内的多种癌症，并预计在两年后面世。这个“新发明”还不会像其它癌症药物一样导致副作用，例如头晕和掉头发。从原理上讲，它会激活免疫系统找出并破坏癌细胞的端粒酶，从而抑制癌细胞的生长。而健康细胞不会遭受攻击，因为它们的端粒酶含量太低，不会引起免疫系统的注意。五、端粒与端粒酶的研究现状存在的困惑1、端粒长度与个体寿命的关系我们现在还不能确定什么样的端粒算正常，多长或多短又算不正常。鼠的端粒比人类长近5-10倍，寿命却比人类短的多，端粒长度与个体寿命及组织器官的预期寿命并不一致。五、端粒与端粒酶的研究现状2、抗衰老与抗肿瘤的矛盾激活端粒酶有助于延缓衰老，但是也面临一些难题，如可能增加罹患癌症的几率；另外，动物不具有类似人的端粒老化机制，而没有适合的模式生物可用于药物测试。五、端粒与端粒酶的研究现状目前人们还不清楚端粒耗损是衰老的原因还是伴随的结果。目前人们也不清楚生物体衰老时细胞老化是怎么导致器官老化的，为什么各个器官