纯化水验证方案

深圳技师学院应用生物系《抗生素药物稀释法与管碟法的抗菌试验》论文项目名称：抗生素药物稀释法与管碟法的抗菌试验项目组长：莫丹项目组成员：班级：10生物J4指导教师：任茜莫全毅二零一三年五月二十日目录一、摘要......................................................................................................................3二、原理........................................................................................................................3三、品名，氯霉素滴眼液............................................................................................3四、试验方法................................................................................................................3五、后记........................................................................................................................7抗生素药物稀释法与管碟法的抗菌试验研究（深圳技师学院J4班，广东，深圳518040)一、摘要(1)用于治病的抗生素除由此直接提取外，还可用人工合成及部分人工合成（称半合成抗生素）的方法制造而得，形成了庞大的抗生素家族，也是临床上广泛应用的抗感染药物。抗生素以前被称为抗菌素，随着科技的发展及广泛地应用，其治疗面不断拓宽，不仅对细菌、真菌等“菌”类致病微生物具有抑制和杀灭作用，而且螺旋体、支原体、依原体等其他致病微生物及恶性肿瘤也有良好的抑制和杀灭作用，故将抗菌素改称为抗生素关键词：抗生素；稀释法；管碟法；抗菌效价(2)目的：根据抗菌药物对液体培养基中试验菌的生长繁殖抑制作用的程度，将能够抑制细菌生长的最低浓度作为衡量指标。MIC值愈小，抑菌作用愈强。二、原理当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。（根据抗菌药物对液体培养基中试验菌的生长繁殖抑制作用的程度，将能够抑制细菌生长的最低浓度作为衡量指标。MIC值愈小，抑菌作用愈强。）三、品名，氯霉素滴眼液主要成分：含主要成份氯霉素20毫克，辅料为硼酸、硼沙、氯化钠、防腐剂药品类别：该品为五官科用药类处方药药品，氯霉素滴眼液,为广谱抗生素，同样属于处方药性状：该品为微黄色或几乎无色的澄明液体。用法用量：外用滴眼，滴于眼睑内，一次1～2滴，一日3～5次。执行标准：中国药典2010年版二部规格：8ml：20mg国药准字H44020212批号130115四、试验方法菌种：藤黄微球菌（Micrococcusluteus）培养基：营养肉汤培养基，营养琼脂培养基，抗生素效价2号培养基，0.9％生理盐水,抗生素3号1.预试验（1）复苏：取藤黄微球菌（Micrococcusluteus）冻干粉一支自然解冻，准备一瓶灭菌好的营养肉汤100ml，无菌操作，（37℃,24h）摇床培养。（2）琼脂斜面：取复苏好的藤黄微球菌（Micrococcusluteus）用接种环顶点沾一下在灭菌好的斜面划线（37℃,24h）培养即可。（3）菌液制备：从上面斜面的培养物中（用接种环顶点沾一下即可）接种于5ml肉汤培养基中，经37℃培养18h，用直径3mm的接种环取一环菌液接种于5ml肉汤培养基中，经37℃培养6h即可，4℃保存。（4）找到藤黄微球菌适合的梯度：从上面斜面的培养物中（用接种环顶点沾一下即可）接种于5ml肉汤培养基中，经37℃培养18h，用直径3mm的接种环取一环菌液接种于5ml肉汤培养基中，经37℃培养6h取出，在无菌操作下，用生理盐水稀释至610，取410，510，10-5做细菌总数计数。稀释梯度至10-5，细菌总数计数表4105106101无法计数86192无法计数7423平均菌落数无法计数8021结论：由稀释梯度至610，细菌总数计数表可知，10-5为我们所需要的梯度。1.试管法（无菌操作）2.药物稀释法（1）预实验：取3号培养基100ml，试管10支，第一管加药物1ml+9ml肉汤充分混合，第二管取第一管中1ml+9ml肉汤混匀，第三管取第二管5ml+5ml肉汤第四管取第三管5ml+5ml肉汤混匀，以此类推至第6管，取出5ml弃去，第七管不加药，只加了营养肉汤5ml。稀释完毕后，十管的药物稀释度为110，210，310…，10-6，及阴性。（2）对照品：取3号培养基100ml，试管10支，第一管加对照品1ml+7ml肉汤充分混合，第二管取第一管中1ml+9ml肉汤混匀，第三管取第二管5ml+5ml肉汤第四管取第三管5ml+5ml肉汤混匀，以此类推至第六管，取出5ml弃去，第七管不加药，只加了营养肉汤5ml。稀释完毕后，十管的药物稀释度为110，210，310…，10-6，及阴性。（3）菌液制备：从上述的菌液中取1ml用生理盐水作为稀释剂梯度稀释至10-5，用灭过菌的移液枪每管加0.1ml，第七管不加菌作为阴性对照，第八管不加药物加菌为阳性对照。加完菌后充分混匀，经37℃培养18h后判断结果。药物稀释法找出最大抗菌效价表，加菌量为0.1ml稀释倍数1:1001:2001:4001:8001:1600阴性阳性样品－－－＋＋－＋对照－－－＋＋－＋抗菌效价（u）2512.56.253.121.06//备注：“－”表示澄清，“＋”表示浑浊，“/”表示没有由药物稀释法找出最大抗菌效价表，可知药液的最高稀释倍数为10000倍，药物抗菌效价为20x1000/8=2500u,第一管为25u，第二管为12.5u，第三管为6.25u。（3）确定（最大抗菌效价，6批）：每批取营养肉汤100ml，试管7支，第一管加药物1ml+9ml肉汤充分混合，第二管取第一管中1ml+9ml肉汤混匀，第三管取第二管5ml+5ml肉汤混匀，第四管取第三管5ml+5ml肉汤混匀，第五管取第四管5ml+1.25ml，第六管取第五管5ml+1.25ml，第七管取第六管5ml+1.25ml，第八管不加菌作为阴性对照，第九管不加药物加菌为阳性对照。药物稀释度为1:10,1:100,1:200,1:400,1:500,1:600,1:700，加完菌后充分混匀，经37℃培养18h后判断结果。药物稀释法扩大梯度范围找出更加准确的抗菌效价表1：5001:6001：700阳性阴性样品＋＋＋＋-标准品＋＋＋＋-抗菌效价（u）543.2//备注：“－”表示澄清，“＋”表示浑浊，“/”表示没有试验结果：本试验所采用的藤黄微球菌在肉汤培养基中，正常情况下均为混浊生长，培养基经培养透明正常，保持原来一样状态，无细菌生长为抑菌（杀菌），以不长菌的药液最高稀释倍数为该药的抑菌效价，由药物稀释法抗菌效价表，可知1:400为最大稀释倍数，最大抗菌效价为2500/400=6.25u。3.管碟法（1）菌液制备：每批取营养肉汤100ml，试管6支，第一管加药物1ml+9ml肉汤充分混合，第二管取第一管中1ml+9ml肉汤混匀，第三管取第二管10ml+10ml肉汤混匀，第四管取第三管5ml+5ml肉汤混匀，第五管取第四管5ml+5ml，第六管取第二管5ml+5ml，药物稀释度为1:100,1:200,1:400,1:800,1：1600。4.培养基的制备：（1）先倒下层（抗生素效价2号培养基，倒入6个平皿凝固。）（2）菌液制备（营养琼脂斜面加入2ml生理盐水混匀洗脱，倒入40ml抗生素效价2号培养基混匀，作为上层。）（3）从40ml中每皿分别取5ml迅速加入6个平皿中，混匀，凝固后作好标记。（每皿做四个标记,1/100两个，1/200两个，1/400两个1/500两个1/600两，1/700两个，1/800两个，1/1600两个.。）（4）每皿加入4个牛津杯，滴加药液到小钢管中，分别按浓度加入1/100两个，1/200两个，1/400两个，1/500两个1/600两个1/700两个，1/800两个，1/1600两个。（5）将平皿盖换成陶瓦盖。（6）恒温培养。（24h，37℃）（7）记录结果管碟法测定最大抗菌效价表（一）1：1001：2001：4001：8001：1600样品＋2.81cm＋2.10cm＋0.93cm－0cm－0cm＋2.95cm＋2.13cm＋0.96cm－0cm－0cm标准品＋3.35cm＋2.10cm＋0.91cm－0cm－0cm＋3.20cm＋2.05cm＋0.95cm－0cm－0cm抗菌效价（u）2512.56.253.121.56备注：“＋”表示有抑菌圈“－”表示无抑菌圈表二1：5001：6001：700样品（cm）－0－0－0－0－0－0标准品（cm）－0－0－0－0－0－0抗菌效价（u）543.2试验结果：本试验所采用的藤黄微球菌在抗生素效价2号培养基中，正常情况下均为混浊生长，培养基经培养正常，保持原来一样状态，在长满细菌的平皿中无出现抑菌圈为抑菌（杀菌），以出现抑菌圈的药液，最高稀释倍数为该药的抑菌效价，由管碟法测定最大抗菌效价表，可知1:400为最大稀释倍数，最大抗菌效价为2500/400=6.25u。讨论：由药物稀释法与管碟法的抗菌试验两者都可以直观看到结果，药物稀释法操作简单快捷，管碟法操作复杂，技术要求较高。药物稀释法的抗菌效价计算较为简单，管碟法无法计算其抗菌效价。参考文献：1．参考了，任茜，李万波，陈国联等，《中国园艺》，2012年第四期第二十八卷，15种木兰属药用花卉抗菌试验研究2．参考了2010版《中华人民共和国药典》指导老师：任茜、莫全毅五、后记通过这个项目，我们进步明显。我们学会了通过参考别人的文章，寻找适合我们的方法，制定出我们需要的方案然后进行了实验，通过查找有关权威的资料参考，学习借用及模拟，最后能按期完成这次项目。在这个过程中，我们也遇到很多问题，也积极向同学及老师请教。在这个项目中，我们真诚的感谢二位导师任茜老师和莫全毅老师，感谢他们对我们第一大组的信任和付出，是他们的信任，放手让我们去思考去实验，去阅读寻找答案，并且每天都轮流着关心与跟踪我们的实验进程及实验过程中遇到的困难还认真耐心地给我们分析及讨论，最后，谢谢学校，谢谢你们给我们这次机会