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CFX96实时荧光定量PCR仪操作流程及注意事项开始运行仪器打开电脑打开定量PCR仪底座开关启动CFXManager软件放置样品将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。设置程序，运行实验定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（ProtocolTab）b.设置反应板文件（PlateTab）。C.点击“StartRun”键，运行程序热循环程序文件（ProtocolTab）设置指南：点击Edit（编辑）或CreateNew（创建新程序）。反应板设置文件（PlateTab）设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“DilutionSeries”键可设置其标准品浓度及稀释倍数。点击“StartRun”键。单击openlid（打开热盖）或Closelid（关闭热盖）放置样品；单击StartRun，保存文件，开始运行程序。结果分析PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct值等。如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单关闭运行仪器实验结束后取出反应管，顺序关闭CFXManager软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。CFXManager软件操作快速指南实验操作程序设置图1显示实验设置窗口中一个预览的程序。点击CreateNew，打开程序编辑器创建一个新的程序。点击SelectExisting，通过浏览器加载一个程序或对其进行编辑。使用ExpressLoad下拉菜单直接加载一个程序或对其进行编辑。点击EditSelected，打开程序编辑器编辑所选程序的各个步骤。点击StartRun开始运行当前加载的程序。程序编辑器程序编辑器可用来创建一个新程序或编辑一个已存在的程序，图2。1．在图形或文本模式下选择任何需要编辑的一步（该步骤会用蓝色高亮显示），点击温度或保持时间进行直接编辑。2．点击InsertStep在程序中增加一个温度步骤。点击DeleteStep在程序中删除选中的步骤。3．点击AddPlateReadtoStep，在程序中指定获取荧光数据的时间。如果当前的高亮显示步骤已经进行了读板设置，则这一选项变为RemovePlateRead。如果在这一步不想获取数据，则点击RemovePlateRead。4．点击GOTO步骤的重复次数，改变程序中的循环次数，图2第4步。点击GOTO步骤数可改变GOTO循环中所包含的步骤。增加一个梯度步骤：1．在程序编辑控制窗口中，点击InsertGradient，图2。2．对梯度中最低和最高温度值进行编辑，在图形模式，文本模式下或出现在文本模式右侧的梯度范围计算器中直接点击数值进行编辑，图3。3．在梯度范围计算器中，对任何一行都可以赋予一个指定的温度。每行的温度都会调整为合适的温度来满足指定的温度范围。增加熔解曲线：1．在程序编辑控制窗口中，点击InsertMeltCurve，图2。2．在图形或文本显示模式下，点击温度值来编辑融解曲线范围的最低和最高温度，图4第5步。3．点击增量值来编辑数据获取的温度区间。4．点击保持时间编辑每一个增量温度的保持时间。CFXManager软件数据分析快速指南定量分析数据浏览扩增图表可以显示实验中每个循环每个孔收集的相对荧光信号曲线。点击位于扩增图表下方的荧光检查窗，选择需要显示的荧光数据，图1。在孔选择器中点击孔，行或列来显示所选孔的荧光数据，图1。选中的孔是蓝色的，未选中的孔是亮灰色的。若把光标置于荧光信号曲线上，孔选择器中的孔上，数据电子表格的孔上，或者标准曲线上均可以显示出相应的信息。数据分析选项CFXManager软件可以自动的扣除从各个孔所得数据的基线。从菜单栏中选择Settings，选择BaselineThreshold可以改变基线范围。软件会自动计算基线的位置。可以点击并拖动阀值线来手动定位。点击工具栏中View/EditPlate按钮来编辑孔的内容，可以临时创建新的分群，从分析中增加或删掉一些孔。图表选项可用鼠标右键点击任何图表来复制或保存图像，或选择ChartOptions来改变轴范围或删除栅格，图2。点击工具栏中TraceStyles按钮，或鼠标右键点击任何图表来设定制定孔的荧光信号曲线颜色。鼠标左键点击任何图表，向下和拖动光标可以放大图表。孔的分群数据浏览使用工具栏中SelectWellGroup下拉菜单来浏览指定孔的分群数据，图3。软件可以针对每个分群作为独立的实验来处理，每一个分群可针对自己的设置进行分析，如进行自身标准曲线的分析。定量数据分析显示选项点击数据分析窗口中QuantitationData，浏览数据计算和统计，包括每个孔的阀值（CT）和平均值以及复制的标准偏差，图4。点击任一列的标题进行基于列的行分类。鼠标右键点击电子表格并选择Sort可进行基于多个列的行分类。鼠标左键点击任一列的标题并向左或向右拖动可以重新排列电子表格中列的顺序。鼠标右键点击电子表格，选择数据输出格式如text，XML或Excel输出数据，图4。从QuantitationData下拉菜单中选择Plate，在反应板栅格模式下显示所选荧光的孔数据。创建报告显示选项点击数据分析窗口工具栏中Report按钮，图1，打开Report窗口，图5。点击报告选项列表中的检查窗，使制定信息包含在报告中，这些信息在预览部分中会有所显示，图5。点击工具栏中File并选择Save，以PDF格式保存报告，或选择Print打印报告。也可以保存报告为其它的文件格式。CFXManager软件基因表达分析快速指南通过严谨的质量控制，您可以使用GeneExpressionModuleofCFXManager软件来评估样品之间靶标浓度的相对差异。这种应用最常用的使用是评估cDNA样品中靶标的浓度来推断其mRNA水平。通常，一个或多个参照基因的含量被用来衡量目标基因的水平。参照基因用来校正上样的差异或各样品取样的差异。通过生物学条件的研究，参照基因的表达水平通常不发生变化。基因表达分析设置图1显示各样品孔含单一的荧光，四个复制类群，包含两个不同靶标名称和两个不同的样品名称。指定参照基因1．点击反应板编辑器中ExperimentSettings或GeneExpressionModule，打开实验设置窗口，图2。2．选择Targets。3．点击合适的检查窗选择将被使用为参照基因的靶标。4．点击ShowAnalysisSettings检查窗，为靶标设置反应扩增效率。5．AutoEfficiency检查窗被默认设定。如果实验中运行一个标准曲线，从标准曲线中计算得到的扩增效率将在计算中被使用。或者对合适的靶标输入指定反应扩增效率值，则计算中将使用这一扩增效率值。指定对照样本1．在ExperimentSettings窗口，选择Samples标签。2．点击合适的检查窗，选择在计算中将被作为对照的样本，图3。对每个基因来说，对照样本的值被指定为1，同时所有其他样本相对于对照样本的值会被显示出来.基因表达分析选择分析模式1．从Mode下拉菜单中选择分析模式，图4：a.NormalizedExpression⊿⊿C（t）-靶标基因的相对量可通过样本的参照基因来进行相对量的衡量。b.相对量⊿C（t）-靶标基因的相对量不能被衡量；结果显示的是实验中靶标基因相对于其他样品的基因浓度。图形选项1GraphData下拉菜单中选择对照相关或零相关的图形数据。在表中，GraphData选项默认是对照相关。2X轴下拉菜单中选择X轴以Sample显示或Target显示。3Y轴下拉菜单中选择Linear，Log2或Log10作为Y轴刻度。4ScalingOption下拉菜单中选择Highest，Lowest或Unscaled。5ErrorType下拉菜单中选择StandardErroroftheMean或StandardDeviation。6鼠标右键点击图形菜单选择Sort选项来指定X轴的显示顺序。7鼠标右键点击图形，复制和粘贴图形或保存图形。电子表格选项8基因表达分析结果会在电子表格中显示出来，图5。9选择任一列的标题，通过列值对数据进行分类。10鼠标右键点击电子表格，结果输出为MicrosoftExcel电子表格或其他文件格式。