组织DNA的提取与纯化

组织DNA的提取与纯化检验系生化教研室陈宁讲课内容概述1试验原则2实验操作及相关试剂介绍3注意事项4一、概述•DNA在生物组织中以核蛋白的形式存在于细胞核中。•单倍体人类DNA平均相对分子量为6×1010道尔顿，相当于1.3×105kb。DNA的分类有：真核DNA细菌DNA病毒DNA质粒DNADNA样品的来源：•组织–肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞•血液•细菌–培养细菌、质粒二、实验原则保证DNA一级结构的完整性排出其他干扰性分子的污染干扰分子对酶有抑制作用的物质样品中存在的其他生物大分子有机溶剂、高浓度的金属离子等蛋白质、多糖和脂类应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度相应抽提对象之外的核酸污染DNA抽提时，应避免RNA干扰相关因素对于核酸的影响：机械剪切力、高温剧热环境过酸、过碱的反应体系各种核酸酶降解效应物理因素化学因素生物因素操作轻柔，切忌剧烈混匀、震荡；控制实验温度pH4~10EDTA缓冲液避免干扰因素的解决方法简化操作步骤，缩短提取过程，减少各类因素对核酸的降解。三、实验操作及相关试剂介绍【实验方法】物理方式：玻璃珠法超声波法研磨法冻融法化学方式：异硫氰酸胍法酚-氯仿抽提法碱裂解法生物方式：酶法酚-氯仿抽提法提取组织组织匀浆水相(DNA,RNA)絮状沉淀(DNA,少量蛋白质,RNA)DNA裂解液苯酚-氯仿离心离心离心氯仿-异戊醇5mol/LNaCl冰无水乙醇75%乙醇TE1.裂解液0.1mol/LNaCl1%SDS（十二烷基磺酸钠）10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTApH8.0阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。抑制DNA酶活性pH值适宜DNA游离至水相，避免降解。2.苯酚-氯仿（3:1，V:V）Tris-HCl饱和操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。3.氯仿-异戊醇（24:1，V:V）经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。4.5mol/LNaCl使水溶液中的DNA易于聚合，从而形成钠盐沉淀。反应体系为pH8.0时，DNA分子所带的电荷为负电荷。加入NaCl溶液后，Na+能够中和DNA外周的负电荷，减少DNA分子之间因同种电荷产生的排斥力，使得DNA分子相互靠拢。5.冰无水乙醇冰：低温条件能降低分子运动，避免DNA破坏，而易于沉淀出DNA。①DNA不溶于乙醇。②乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。③乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。所以，之前须加入5MNaCl。6.75%乙醇洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。7.TE缓冲液TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控pH。TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性。DNA在TE提供的环境中稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂。包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存。【操作】抽提组织加入裂解缓冲液制成匀浆加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min吸取上清液至干净离心管加入等体积氯仿-异戊醇，摇匀5min，2500rpm离心10min记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀2500rpm离心10min，弃去上清液加入1ml75%乙醇混匀，2500rpm离心5min。弃去上清液后再重复一次沉淀DNA去除多余乙醇后，在快干时（半透明状）加入2mlTE缓冲液检测DNA浓度、纯度加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min苯酚-氯仿试剂具有挥发性，对人体有毒。故，使用完毕后及时盖上试剂瓶盖，保持实验室良好的通风。如果发生试剂溅滴至皮肤、粘膜，务必及时用流动水冲洗。记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀5mol/L×VNaCl=0.3mol/L×(V上清液+VNaCl)VNaCl=（3×V上清液）/47检测DNA浓度、纯度取完全溶解后的DNA原液进行1:100稀释，即1μl原液+99μl水，混匀。紫外分光光度计检测：A260=?A280=?DNA纯度鉴定A260/A280＜1.6≈1.8＞2.0酚、蛋白质污染视为纯度较高的DNARNA污染DNA浓度鉴定DNA(μg/ml)=A260×稀释倍数×50×1/光径DNA在260nm处存在吸收峰检测时对于原液的稀释程度1OD相当于：50μg/mlDNA40μg/mlRNA20μg/ml寡核苷酸四、注意事项组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止DNA降解。剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。思考题•整个实验过程中，一共有几次离心？每次离心的作用是什么？各个分层中的内容是什么？TheEnd请至507、509教室进行试验操作，谢谢！