组织培养基本技术与基本知识

1组织培养基本技术与基本知识2005.10.152目录前言------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5第一章基本技术---------------------------------------------------------------------------------------------------6第一节原代细胞单层静止培养的设备与器材准备--------------------------------------------------------------6一、设备与器材二、器材的清洗第二节原代细胞单层旋转瓶培养的设备与器材准备------------------------------------------------------11一、设备与器材二、器材的清洗第三节组织培养用水的制备和各种溶液的配制----------------------------------------------------------12一、水（双蒸水、三蒸水或去离子水）二、汉克氏（Hanks）原液和汉克氏液三、0.5%水解乳蛋白----汉克氏液（简称乳汉液）的配制四、7.5%的碳酸氢钠（NaHCO3）配制五、胰蛋白酶的配制六、犊牛血清的制备七、每毫升含1万单位双抗（青霉素与链霉素）的配制八、每毫升5万单位制霉菌素的配制九、营养液与维液的配制第四节器物与溶液的包装、灭菌和无菌操作-------------------------------------------------------------16一、包装与灭菌二、无菌操作第五节无菌检验---------------------------------------------------------------------------------------------------23第六节原代单层细胞的制备------------------------------------------------------------------------------------24第七节细胞计数和染色------------------------------------------------------------------------------------------26一、细胞计数二、细胞染色第八节培养细胞的观察---------------------------------------------------------------------------------------27一、培养细胞的生长和繁殖二、在单层细胞培养中细胞的形态观察3第九节原代单层细胞培养中应注意的问题------------------------------------------------------------------29一、应注意的问题二、可能会出现的问题第二章在组织培养的细胞中病毒的接种与毒价的滴定（测定）--------------------------------------31第一节在组织培养的细胞上病毒的接种方法--------------------------------------------------------------32一、用敏感细胞分离病毒二、病毒在敏感细胞中的传代三、接种后细胞病变（CPE）的观察与判定标准第二节在组织培养细胞中病毒毒价的测定----------------------------------------------------------------34一、病毒毒价测定操作方法二、半数细胞病变终点（TCID50）计算第三章基本知识-------------------------------------------------------------------------------------------------41第一节影响离体细胞生长繁殖的一些因素-----------------------------------------------------------------41一、温度二、氢离子浓度三、水四、渗透压与无机盐类A、细胞所需无机盐离子的作用B、无机盐类对平衡渗透压和维持pH的作用五、气体六、细胞接种浓度七、容器转动速度第二节细胞的营养物质-----------------------------------------------------------------------------------------49一、碳水化合物二、氨基酸和水解乳白蛋白三、血清（一）、血清的作用（二）、与血清有关的几个问题四、维生素第三节消化液的应用--------------------------------------------------------------------------------------------564一、胰蛋白酶二、乙烯二胺四乙酸（Versene，EDTA）三、胶原酶四、Pronase第四节抗菌素的应用--------------------------------------------------------------------------------------------61一、青霉素二、链霉素第五节传代细胞与细胞悬浮培养-----------------------------------------------------------------------------62一、传代细胞二、细胞悬浮培养第四章附录--------------------------------------------------------------------------------------------------------65附录Ⅰ猪瘟兔化弱毒细胞冻干疫苗（旋转瓶培养）制造及检验办法-----------------------65附录Ⅱ禽苗的鸡胚细胞苗试制-------------------------------------------------------67附录Ⅲ应用驴胎肺等二倍体细胞生产马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原操作方法—---------685前言为了适应我国畜牧业的发展，防止各种畜、禽流行病的爆发和流行，需要生产大量的家畜家禽的各种疫苗，而目前不少疫苗的生产尚未探取组织培养的方法，存在着成本高，费人力，劳动强度大，有些疫苗的原料比较难于得到或需要耗费较多的家畜或家禽，例如狂犬疫苗的生产，目前还是采用绵羊的脑子来制造，一只羊只有脑子能利用。因此，国内有不少兽医生物制品厂和研究单位已探取组织培养的方法生产各种疫苗。例如：猪瘟疫苗的生产，原采用乳兔和黄牛进行生产，而现在已推广仔猪肾细胞组织培养方法生产，一对仔猪肾所生产的苗就相当于以前500—1000只乳兔或30—40头黄牛所生产的量，这不仅使成本成倍的下降，原料易得，节省了人力，而且使劳动强度大大减轻。除此之外，口蹄疫甲型和乙型的组培灭能苗和甲型组培弱毒苗已进行试生产，猪水泡病的组培弱毒苗与组培反映苗也正在进行试制。鸡马力克氏病和新城疫Ⅰ系和Ⅱ系组培苗许多单位在进行试验，并已取得可喜成果。另外如鸭瘟、羊痘等组培苗的生产也在进行试验，并已看到初步苗头。以上的简略介绍仅涉及到组织培养技术在动物疫苗生产方面的应用，而这一技术在免疫学和病毒学中还有着许多方面的应用，如病毒性疾病的诊断；马传染性贫血病的诊断抗原—补体结合反应抗原和琼脂扩散反应抗原，在国内乃是行之有效而广泛采用的方法。利用组织培养：细胞作中和试验以诊断一些病毒性也是经常采用的。另外组织培养技术在病毒的分离、监定和繁殖规律：研究以及病毒毒价的测定等方面都是不可缺少的手段。尤其当用于医学时，组织培养方法能够克服在人医中不能用人进行实验的困难。组织培养技术除了在病毒学和免疫学和医学中有多方面应用外，其应用范围还极其广泛。如细胞学、肿瘤学、药理学等方面以成为不可缺少的工具，而且在遗传学、发生学、生物化学、生理学、放射生物学等方面也有广泛的应用价值。然而，事物总是一分为二的。组织培养使组织或细胞在体外生长繁殖以便于进行多方面研究和应用。但是，机体内外环境却是极为不同的。在体外，则使组织或细胞处于不正常的条件下，必然会引起许多变异。因此，当我们要把体外的实验结果应用于机体内时，尤其在人医方面，必须加以慎重考虑和修正才有其实用价值。不过对我们兽医方面用组织培养方法来制造疫苗则问题不大。组织培养既然有如此广泛和重要的应用，那么究竟什么是组织培养呢？组织培养就是将各种各样的生物（包括人、动物和植物）的器官组织或细胞从机体中取出，人工培养于各种各样的玻璃或其它器皿内，使组织或细胞在体外得以生存、生长和繁殖。人们可以利用这种体外生长的组织或细胞进行各种科学研究或从事病毒疫苗的生产。6组织培养技术一般来讲，可以分为三个不同水平：即器官水平（器官培养）、组织水平（组织块培养）和细胞水平（细胞培养）,通常所说的“组织培养”是包括了组织培养与细胞培养二者的通称，因为二者有时不好绝然分开。所谓组织培养也是由组织中长出细胞来，培养的仍是细胞。我们所要讲的也是应用最广泛的细胞培养。而“器官培养”则是用某些措施使器官的原基，器官或器官的一部分在体外存活、生长、分化，并且保持其原有的结构和功能。组织培养的具体方法是很多的，但归纳起来不外为悬滴培养，器官或组织块培养、细胞的单层培养和悬浮培养几种。在单层培养中又有静止培养和旋转瓶培养。组织培养的历史开始于上世纪中。各参考书中都有详细介绍，阅读时应注意历史唯心主义和英雄史观的影响。组织培养技术与其它科学一样，是随着生产实践的发展，龙其是医学、病毒学和免疫学实践的需要以及其它科学的发展而经历着产生和发展的各个阶段。目前，组织培养技术已有极大的发展，已成为现代科学实践中一项不可缺少的手段。这一技术近年来在我国的兽医界中已有了较普遍的使用。第一章基本技术本章所要介绍的基本技术仅指目前国内一些兽医生产和研究单位所普遍采用的细胞单层培养。包括单层静止培养和旋转瓶培养也包括原代细胞培养和传代细胞培养。第一节原代细胞单层静止培养的设备与器材准备一、设备与器材（一）无菌间（或无菌罩或超净工作台）1间（或1台）（二）较大型设备：电热恒温培养箱1个冰箱（包括普通冰箱和低温冰箱）各1台高压蒸汽消毒器1台电热鼓风干燥箱1台恒温水浴（双孔或四孔）1台离心机（台式或座地式均可3000—5000转/分）1台真空泵1台普通天平（感量0.1克）1架离子交换纯水器或蒸馏器1套显微镜（普通生物显微镜）1台7（三）解剖器械：镊子——手术镊尖头1把钝头1把眼科镊直头1把弯头1把剪刀——手术剪2把眼科剪直头1把弯头2把解剖刀——手术刀2把（四）玻璃器皿：培养瓶（中性、无色透明硬质玻璃、耐高压）视培养需要而取不同容量的各种瓶，如：克氏瓶500或1000毫升或其它容量方瓶20、25、50或100毫升盐水瓶500毫升链霉素瓶10毫升培养皿2套漏斗1个（大小视过滤物的量而定）烧杯（50或100毫升）1个细颈三角瓶（50、100毫升或更大，视取材大小而定）1个玻璃杯若干吸管（1毫升、10毫升）各1支注射器（20毫升）1个500毫升或更大的盐水瓶（或三角瓶盛各种培养液用）若干（五）橡皮制品橡皮塞（号数视各种培养瓶而定，但应选白色的）各若干橡皮球（大、小）各三个乳胶管（内径约3——4毫米）1米（六）其它血球记数器1个血球记数板1块8脱脂纱布（13×13厘米2左右，2层厚）1块棉花、纱布、纸（旧报纸、牛皮纸或硫酸纸）小线绳或纸绳各若干铝饭盒、菜盒或其它容器（装较小的培养瓶、橡皮塞等用）若干个架或盘（木制或金属制均可。放培养瓶用）若干G6号耐酸玻璃滤器或赛氏滤器（容量为200——5