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实验一组培器皿及器械的洗涤、灭菌及环境的消毒一、实验目的通过实验，使学生了解并掌握组织培养用实验器皿及器械的洗涤、灭菌，环境的消毒方法。二、实验原理实验仪器及器械的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在，是外植体免受污染的前提。由于灭菌剂的种类不同，所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。无菌的环境是植物组织培养成功的前提，因为绝大多数操作程序要求在无菌条件下进行。三、实验操作步骤（一）器皿与用具的洗涤1、玻璃器皿的洗涤新购置的玻璃器皿或多或少都含有游离的碱性物质。使用前要先用1%稀HCL浸泡一夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗后，再用蒸馏水冲洗1次，晾干后备用。用过的玻璃器皿，用清水冲洗，蒸馏水冲洗一次，干后备用即可。对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后，倒去残渣，用毛刷刷去瓶壁上的培养液和病斑后，再用清水冲洗干净，蒸馏水冲淋一遍，晾干备用，切忌不可用水直接冲洗，否则会造成培养环境的污染。清洗后的玻璃器皿，瓶壁应透明发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。2、金属用具的洗涤新购置的金属用具表面上有一层油腻，需擦净油腻后再用热肥皂水洗净，清水冲洗后，擦干备用。用过的金属用具，用清水洗净，擦干备用即可。3、每人清洗部分玻璃器皿清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。对于较脏玻璃器皿的洗涤：采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液（一种强氧化剂，去污能力强，配制方法：重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸），浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。1对于带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。（二）玻璃器皿、用具及环境的灭菌1、玻璃器皿和用具的灭菌（1）采用干热灭菌法：将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具，用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100℃时，启动箱内鼓风机，使电热箱内的温度均匀。当温度升至150℃时，定时控制40min（或120℃定时120min）,达到灭菌目的。（2）采用高压蒸汽灭菌法：即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15～20分钟。有些如聚丙烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进行高温消毒。（3）灼烧灭菌：用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外，在接种过程中还常常采用灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。2、环境的消毒（1）地面、墙壁和工作台的灭菌每次使用前，将配好的20%新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液倒入喷雾器中，对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。然后开启紫外灯开关，照射15～30min，一般紫外线消毒后不要立即进入，应在关闭紫外灯15-20min后进入室内。（2）无菌室和培养室的灭菌消毒灭菌的方法：首先将房子关闭，定期用甲醛和高锰酸钾2：1的比例定期熏蒸灭菌24h或用70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾，封闭消毒期间不宜进入消毒空间。三、实验报告1．将本次实验内容整理成实验报告。2.试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？2实验二培养基母液的配制与保存（MS培养基）一、实验目的通过学习MS培养基母液的配制与保存，掌握培养基母液浓度的换算、配制与母液的保存方法。二、实验原理培养基制备之前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当制备培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。三、实验仪器、用具及试剂（一）实验仪器、器皿及用具电子天平（感量为0.0001g、0.01g）,烧杯（1000ml，100ml，50ml）、量筒（1000ml，100ml，50ml）、容量瓶（1000ml，500ml，200ml，100ml，50ml）、棕色或白色广口瓶（1000ml，500ml，200ml，100ml）、药匙、玻璃棒、称量纸、标签、冰箱。（二）试剂MS培养基所需各种试剂、IAA、IBA、NAA、6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸馏水、重蒸馏水。四、实验步骤与方法母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO42-,Ca2+,Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。现以MS培养基(Murashige和Skoog,1962)为例叙述如下：(一)、大量元素母液（浓缩10倍）的配制MS培养基配方中大量元素共有5种（表1-1），按照培养基配方的用量，各种化合物扩大10倍，用电子天平分别称好，分别用50ml烧杯称量，加30-40ml蒸馏水溶解。5种化合物分别充分溶解后，按顺序混合定容在1000ml量筒中，注意在混合定容时，一定要最后加入氯化钙，因为氯化钙与磷酸二氢钾形成磷酸3三钙，磷酸钙之类是不溶于水的沉淀（也可将钙盐与镁盐单独配成母液存放），将配好的定容溶液倒入1000ml广口瓶中，贴好标签保存于冰箱的冷藏室中。配置培养基时，每配1L培养基取此母液100ml。表1-1Murashige和Skoog大量元素的称量及定容化合物名称培养基配方用量(mg/L)扩大10倍称量(mg)用于定容KNO3190019000NH4NO3165016500MgSO4·7H2O(无水MgSO4)370（190）3700（1900）KH2PO41701700CaCl2·2H2O(无水CaCl2)440（330）4400（3300）（二）、微量元素母液（浓缩100倍）的配制MS培养基配方中微量元素共有7种（表1-2），按表中称取用量，用感量为0.0001g电子天平，分别称取后，均放入1000ml的一个烧杯中，加蒸馏水溶解，然后定容到1L容量瓶。贴好标签，放入冰箱保存。配置培养基时，每配制1L培养基取此母液10ml。表1-2微量元素母液各化合物用量化合物名称培养基配方用量(mg/L)扩大100倍称量(mg)用于定容MnSO4·4H2O(MnSO4·H2O)22.3(16.9)2230(1690)ZnSO4·7H2O8.6860CuSO4·5H2O0.0252.5H3BO36.2620Na2MoO4·2H2O0.2525KI0.8383CoCl2·6H2O0.0252.5(三)、铁盐母液（浓缩200倍）的配制目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，比较稳定，又不易发生沉淀。配制方法是：用感量为0.01g的电子天平称取硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g分别溶解在200ml蒸馏水中，两种溶液混合定容至500ml，用棕色广口瓶盛装，贴标签，放入冰箱保存。注意：两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。配置培养基时，每配制1L培养基取此母液5ml。4(四)、有机物母液（浓缩100倍）的配制在MS培养基中，有机物配方成份有维生素和氨基酸（表1-3）。按表1-3中的用量用电子天平进行称量，分别溶解，混合定容至100ml。贴标签，放入冰箱保存。配置培养基时，每配制1L培养基取此母液10ml。表1-3有机物母液的称量化合物名称培养基配方用量(mg/L)扩大100倍称量(mg)VB1(硫胺素)0.44.0VB5（盐酸吡哆醇）0.55.0(NaOH溶解)VB6（烟酸）0.55.0(NaOH溶解)肌醇1001000甘氨酸220（五）、生长调节物质（激素）母液的配制（浓度1mg/ml）激素的使用比较灵活，要根据培养的植物种类和目的而定。为了操作方便，节约时间，激素也可如同配制上述母液一样，先配成浓缩母液（1mg/ml），这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。生长调节物质一般不溶于水，可先用少量不同的溶剂来溶解。例如，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（Ze）可先用少量95%酒精助溶，然后再加蒸馏水定容至刻度。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（6-BA）可先溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解（见附表2）。用电子天平分别称量各种生长调节物质50mg，并先用相应的少量有机溶剂进行助溶，再加蒸馏水定容至50ml，可得到浓度为1mg/ml的生长调节物质母液,即配制的母液每毫升含有生长调节物质1.0mg。贴好标签，写明配制的激素浓度，存于冰箱保存（0~4℃）。配制培养基时，如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取0.5ml母液即可。注意：各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，使用中防止污染和沉淀（贮存温度过低时会产生针状结晶），发现有沉淀或霉团时，则不能继续使用。五、实验报告1、将本次实验内容整理成实验报告。2、制备母液时应注意哪些问题？为什么？3、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、PH值，按MS配方计算各种母液吸取量，填入下表：5表1-5按MS配方需要量和母液浓度计算各种母液吸取量并填入下表药品名称MS配方需要量母液浓度配制培养基母液吸取量/ml1000ml500ml300ml大量元素10倍液微量元素1000倍液铁盐5ml/LVB1(硫胺素)0.4mg/L1mg/LVB6（烟酸）0.5mg/L1mg/LVB5（盐酸吡哆醇）0.5mg/L1mg/L甘氨酸2mg/L2mg/L肌醇100mg/L20mg/L2，4-D0.5mg/L1mg/LKT1mg/L0.5mg/L蔗糖20g/L琼脂8g/LPH值5.86实验三MS固体培养基的配制及灭菌一、实验目的通过MS培养基的配制，学习培养基配制与灭菌的操作方法。二、实验原理植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择一个符合实验材料需要的适宜培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物质、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。三、实验仪器、用具及试剂（一）实验仪器、器皿及用具移液管（枪）、量筒（50ml、500ml）、电炉（或微波炉）、pH值试纸（或酸度计）、不锈钢锅、培养瓶、标签、记号笔、高压灭菌锅、烧杯（300ml、500ml、1000ml）、封口膜等。（二）试剂配制MS培养基的各种母液、6-BA（1mg/ml）、2，4-D（1mg/ml）、0.1NNaoH、0.lNHCl、琼脂、蔗糖、蒸馏水。四、实验步骤与方法（一）培养基的配制与分装1、计算各种母液的用量（按配制1000mlMS培养基计算）根据配方计算母液用量，以此配方为例：1LMS+2，4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂，PH=5.8。通过计算得：大量元素（10倍）取100ml、微量元素（100倍）取10ml、有机物（100倍）取10ml、铁盐（200倍）取5ml、2，4-D取1.0ml、6-BA取0.5ml、蔗糖30g、琼脂8g。2、每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素，备用。3、每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂8g，在石棉网上加热熔解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入取好的各种母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸