细胞体外加力的实验方法

细胞体外加力的实验方法研究目的•骨组织的主要功能结构支撑。•力学刺激下，骨的结构变化（骨生成和骨吸收），以适应相应的力学环境。•力学环境包括生物体外、体内细胞之间的相互作用力和细胞内张力等。——力学系统。•目的：更好地理解细胞的结构一功能关系及调节机制,必须结合力学观点加以研究。研究现状实验方法：在体环境：异常复杂,各类细胞各有特点，细胞之间关系复杂。离体环境：细胞生理或病理现象的研究仍依赖于体外分离、培养。人体细胞尺度在十几至几十个微米之间,细胞膜的厚度仅有几个纳米至几十个纳米。因此,常规的宏观力学加载方法和实验技术无法直接使用。细胞力学实验研究关键在于细胞的体外加载技术。在此基础上,通过显微、摄像及计算机图像处理系统,对细胞的生长及其形态变化进行观测与分析。体外细胞力学加载方法•新近发展起来的方法包括:滴孔技术(pore)、探压技术(poringtechnique)、悬浮技术(suspendingtechnique)、激光捕息法(lasertrap)、双微滴管技术、流动小室(flowchamber)和细胞过滤时间分析仪(celltransittimeanalyzer),基底应变加载技术(substratestretchloadingteehnies),细胞分子学加载技术(cellmolecularloadingtechnics)等。•大体分为三类：模拟体内力学环境的加载方法模拟体外力学环境的加载方法研究单细胞力学特性的加载方法♣模拟体内力学环境的加载方法•利用对细胞粘附的基底材料进行间接加载,通过对基底材料加载后使基底材料的应变传递到细胞上,如四点弯曲梁的单向应变加载和膜材料的双向应变加载方法、气体加压加载技术,以及三维加载技术等.a.简单延长b.单纯轴拉伸c.双轴拉伸d.四点弯曲梁■利用静水压使膜拉伸■通过气体流入使膜拉伸■机械力使膜拉伸Petriperm弹力膜培养皿•90年代初问世。其原理就是通过弹性底面的形变,使附着于该底面的细胞受到牵张力。实验通过调节弹性底面圆心的垂直形变量,达到调节细胞受力的目的。另外附加一些机械装置,可以调节力的周期。•优点：加力方式较为接近正畸临床牙齿受力状态,；避免空气液体传导静压力加力装置对实验周期的限制；可用于体外细胞培养的持续性、间歇性间歇性牵张力。•价格十分昂贵。1.培养液2.细胞3.无底培养皿4.压力5.基座6.水7.出水口8.进水口9.培养膜细胞化学方法染色细胞内的琥珀酸脱氢酶为阳性,膜上显示蓝紫色颗粒,表明体外培养细胞能在膜上生长;选用聚醚砜滤膜,价格低廉,为多次重复实验提供了可能,加力以后可以在其上进行细胞染色、原位杂交、免疫组化染色等技术。流体剪切应力加载装置平行平板流动室锥板流动室高度宽度与长度利用流入管与流出管压力差使细胞受到均匀或脉冲的剪切力。优点：细胞在受力时仍保持与基底的粘附缺点：利用培养液流动产生力的作用，生化成分检测困难透明锥板与平板以相同速度反向运转，获得稳定层流，使其间的细胞受到稳定、均匀、较大范围的剪切力。复杂流体剪切应力装置♣模拟体外力学环境的加载方法•离心力加载装置•空气液体传导静压力加载装置离心力加载装置原理：经分离培养得到的离体细胞在离心力作用下受到离心力、重力、细胞与细胞基质间的摩擦力。用于观察失重状态下细胞变化,对重力生理学和航天生物学具有独立的理论、实际意义。缺点：细胞间、细胞与基质间无附着关系，从而影响细胞的功能状态，无法反映真实的细胞生理状态。空气液体传导静压力加载装置气体密闭室流体密闭室可以研究液压对细胞周期、骨架微丝微观形态的影响。优点：设备简单、操作方便、易于传递载荷、细胞受载均匀缺点：环境密闭，培养条件不易维持，不利于长时间观察♣研究单细胞力学特性的加载方法微管吸吮技术发展：20世纪30年代,cole采用挤压的方法研究海胆卵的弹性构造；——照片上不能准确地确定接触面积;Norris细各一微形针置于红细胞中,测量针的弯曲变形确定作用力；——这一方法难以实现；50年代中期,微管吸吮技术出现。采用显微技术和微管吸吮方法直接对单个细胞进行加载,通过实时记录系统记录,利用图像处理仪和计算机进行位移测量及变形数值分析。•应用：检测单个细胞或细胞对变形和粘附的重要手段。微管吸吮技术•组成：由微吸管、显微操作器、倒置显微镜、负压加载系统、磁带实时记录系统、图像处理仪、计算机等组成•优点：测量精细，易于标定；重复性好•缺点：检测对象为单个细胞；变形部分膜张力不均；技术方面的校正•技术遵循基本假定:细胞膜与玻璃管之间没有磨擦力(通常管的表面涂有一层蛋白质);动态条件下,培养液流体粘性力相对于细胞自身的粘性力是可以忽略的。分子水平加载技术•原理：通过对细胞表面受体施加磁场扭曲力的方法,测量细胞骨架刚度的变化。•过程：微米级的永久性磁球,表面结合蛋白质分子使磁球与细胞膜受体结合;外加磁场磁化磁球,在垂直方向加一个均匀弱磁场使磁球旋转;此时如果受体与细胞骨架连接在一起,细胞骨架对磁球的旋转产生阻力。•测量：测量磁球产生的磁场力的变化,定量地获得细胞内的力学参数。外力矩和应力可以用标准粘性物质标定,磁球旋转的角度可以用磁力测量仪测定。•优点：施力恒定，受力均匀，磁力定量，方便定位；可以测量细胞受体分子水平的力学性质。从外界力到功能•应力/应变影响细胞的形态,到达感应细胞的感受器；•获知到应力刺激后，细胞信号传导通路将机械信号转化为生物化学信号；•传导到达效应位点，调节相关分子的表达，最终影响细胞的功能活动。展望•不同的实验技术所获得的实验结果可比性较差.与细胞本身力学性能的复杂性相关外,还有实验手段、方法、原理的限制。•开发模拟紊流和过渡流的实验装置；•开发外界与内部环境多力学因素作用力学模型•模拟力学——化学因素共作用的环境•借助于声、光、电、磁等其它学科的技术,改进和完善原有技术•开发用于观察细胞力学信号传导机制用于测量传导过程中分子的变化•开发精确地测量细胞的应力、应变关系的实验系统