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山东大学实验报告年月日姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者科目分子细胞生物学题目细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响学号2010002320121【实验目的】1．细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响。2.熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。3．了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。4．了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。【实验原理】1.滋养层细胞的制备在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是滋养层细胞。至于滋养层细胞可以促进其它细胞生长的原理目前有两种解释：一种解释是滋养层细胞可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用；另一种解释是滋养层细胞可以释放出一些必要的生长因子，可以促进目的细胞的生长。在单抗制备过程中，刚刚融合的细胞和克隆化的细胞都比较难以生长，因此都需要添加滋养层才能较快地生长。在介绍滋养层细胞之前，先来介绍一下制备单抗的培养基体系。RPMI1640培养基（RoswellParkMemorialInstituteMedium1640）RPMI1640培养基（下面简称1640）最初是RoswellParkMemorialInstitute用来培养人的淋巴细胞的培养基，后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中。商品化的1640大多以固体形式出售，也有少数是配好的液体。有的商品化1640中不含碳酸氢钠（稳定pH作用）、不含HEPES（稳定pH作用）、丙酮酸钠（提供碳源）、谷氨酰胺，配制前需要仔细阅读说明书，按照说明书的要求加入需要额外加入的成份，尤其是谷氨酰胺，它是细胞增殖必不可少的成份，而且谷氨酰胺特别容易分解，配制完培养基后应该尽快用完，暂时不能用完的放在4℃或者-20℃保存。大部份商品化的1640培养基中都含有酚红作为酸碱指示剂，1640的pH为7.2-7.4，指示剂显示为红色（如果偏酸则显黄色，偏碱则呈紫色）。DMEM培养基（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium）是在BasalMediumEagle的基础上改进的，最初用于鼠胚胎细胞的培养，后来广泛地应用于各种贴壁细胞的培养或者发酵罐培养。与1640培养基相比，DMEM培养基营养更为丰富。DMEM培养基有两种类型，一种是高糖型，主要用来培养高密度悬浮细胞，另一种是低糖型，主要用来培养普通的贴壁细胞。与1640培养基一样，商品化的DMEM培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定的成份。由于单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞，因此上述两种培养基都可以用来培养杂交瘤细胞。但是这些培养基并不能直接使用，而在使用之前需要加入15%-20%胎牛血清（推荐使用Hyclone公司、Gibco公司或四季青公司胎牛血清），胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因子和激素等活性物质，添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基，否则称作不完全培养基。在单抗制备中，由于需要进行选择性杀死非目标细胞，所以使用添加HAT的选择性培养基，通常HAT中，H（次黄嘌呤）的浓度为1×10-4M，A（氨基蝶呤）为4×10-7M，T（胸腺嘧啶）为1.6×10-5M，在HT培养基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同HAT。另外，在细胞培山东大学实验报告年月日姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者科目分子细胞生物学题目细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响学号2010002320122养中，一般都加入抗生素防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml）、四环素(50ug/ml)、庆大霉素（50ug/ml），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用，俗称“双抗”。由于细胞培养中几乎所有的成份对高温都不稳定，所以绝对不能使用高温灭菌，而是采用0.22um滤膜过滤除菌。通常，先配好不完全培养基（要加抗生素），然后在超净台上抽滤、分装，取少量分装的培养基加入至液体LB培养基里37℃培养过夜进行无菌测试，其它的培养基则放在-20℃保存。确认培养基无菌后才能使用。HT、HAT则配成相应的母液（可用PBS配制，也可以用不完全培养基配制，一般配为50×浓度保存）。培养基使用前根据需要加入HAT或HT以及血清才可以使用。脾脏细胞。脾细胞与杂交瘤的来源细胞上有很高的同源性，因此与杂交瘤的“兼容性”较好，是作为滋养层的不错选择。其制备方法和腹腔巨噬细胞过程类似，只是需要剪开腹膜，取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器（建议使用一次性培养皿，养细菌用的那种比较便宜），用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，收集离心，计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程，一只老鼠的脾脏细胞总数约为2×108-3×108个，以96孔为例，每孔需要约1×105个脾细胞。其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，剪开腹膜，取出脾脏，用镊子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器（建议使用一次性培养皿，养细菌用的那种比较便宜），用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞1200RPM离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基（用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT），用巴氏管反复吹打均匀，可用血球计数板计数（一只老鼠的脾脏细胞总数约为2×108-3×108个，以96孔为例，每孔需要约1×105个脾细胞）。稀释好后，用巴氏管吸取此滋养层细胞按合适的体积滴到96孔板或24孔板上（平均每只老鼠的脾脏细胞可铺两至三块96孔板）。滋养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。需要指出的是，滋养层并不是培养杂细胞一定必须的，但是它确实可以在很大程度上提高细胞的成活率、加快细胞生长速度，因此强烈推荐使用滋养层。2.细胞原代培养技术细胞培养(cellculture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学山东大学实验报告年月日姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者科目分子细胞生物学题目细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响学号2010002320123和生物因素对细胞结构和功能的影响。细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。所谓原代培养(primaryculture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cellline)和细胞株(cellstrain)这两个容易混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体所组成；而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持续存在。细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响，故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。3.细胞传代培养技术传代培养(subculture)是体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。4.细胞的的冻存和细胞的复苏在低于-70度的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。冻存：将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70度的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。复苏：是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。5.MTT法MTT法：MTT法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的体外抗癌药物敏感性的测试方法，目前已被广泛用于抗肿瘤药物体外筛选实验。其作用的基本原理如下：活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑[3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazoliumbromide,MTT]为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲臜的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸收度（OD值）而得知，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。其特点：MTT法是一种检测细胞活性的方法。与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种山东大学实验报告年月日姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者科目分子细胞生物学题目细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响学号2010002320124常规方法--细胞计数法和同位素掺入法相比，MTT法具有操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，广泛用于生物医学的诸多领域，包括抗癌新药的体外筛选和抗癌药物相互作用的研究。【实验材料】1.器材：试管，吸管，橡皮头，培养瓶（都须彻底清洗，烤干，包装好，灭菌后备用）倒置显微镜，酒精灯，酒精棉球，试管架，CO2细胞培养箱，灭菌工作服，口罩，帽子，超净工作台，镊子，注射器，筛网，离心机，巴氏管，血球计数板，大头针，二氧化碳培养箱，眼科剪，眼科镊，培养皿，培养瓶，离心管，微量加样器，吸管，酒精灯，培养基，盖玻片，滴管，显微镜，恒温水浴箱冰箱（4℃、-20℃、-70℃），培养箱，液氮，冰箱，吸管（弯头、直头），废液缸，移液管（10ml），冻存管（1～2ml），微量加样枪，医用橡皮膏，移液枪，酶联免疫检测仪，摇床。2.试剂：PBS，0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA钠盐液，DMEM液，3%谷氨酰胺，小牛血清，7.4%NaHCO3，1万单位/ml青、链霉素溶液，0.5%台盼兰染液，D-Hanks液，小牛血清，培养液双抗（青霉素、链霉素）胰蛋白酶（0.08%），1NHCl，7.4%NaHCO3，DMSO或无色新鲜甘油，MTT(5mg/mL),二甲基亚砜。以上试剂均需分装，包扎好，灭菌后备用。3.材料：小鼠若干【实验步骤】0.总纲：（1）制备滋养层细胞，供脾脏细胞传代培养用（2）制备脾脏细胞，加入到