细胞生物学实验-细胞骨架的观察

实验四细胞骨架的观察细胞生物学实验细胞骨架的观察•实验目的•实验原理•仪器、材料与试剂•实验步骤•实验报告及思考题实验目的掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞微丝的方法。细胞骨架的观察实验原理细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微丝（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）、中间纤维（intermediatedfilament，IF）。细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长等生命活动密切相关。细胞骨架的观察仪器、材料与试剂仪器：光学显微镜，温箱，细胞培养设备材料：平皿，烧杯，载玻片（为区别细胞的正反面，剪掉一角），体外培养的贴壁生长细胞、植物、镊子试剂：磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.4），.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8），M-缓冲液，1％TritonX-100（用M-缓冲液配），0.2%考马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）细胞骨架的观察实验步骤细胞骨架的观察A动物细胞的微丝观察1）将细胞培养在盖玻片上，未致密时即可使用。取出盖玻片，用PBS洗3次。2）室温下用1%TritonX-100处理20-30min。3）用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。4）略晾干后，用3.0%戊二醛固定细胞10min。5）用PBS洗数次，滤纸吸干。6）用0.2%考马斯亮蓝R250染片子30min。蒸馏水冲洗，在空气中自然晾干。7）在光学显微镜下先用10×物镜再用40×物镜观察。实验步骤B植物细胞的微丝观察1）去植物茎表皮约1cm2，放入盛有0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH6.8）的小烧杯中。2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100处理洋葱表皮25-40min。3）除去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10min。4）加3.0%戊二醛固定40min。5）用PBS洗3次，滤纸吸去残留液体。6）0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。7）用蒸馏水洗数遍，降低背景。8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。细胞骨架的观察实验报告及思考题1画出所观察到的微丝图像。2说明在实验中1%TritonX-100处理细胞的作用是什么？3说明M-缓冲液的作用是什么？4考马斯R250和G250的区别是什么？5考马斯R250和鬼笔环肽对细胞骨架的染色有什么区别，各有什么优缺点？6简述微丝动态平衡过程中各种条件及作用。7ATP在微丝动态平衡中所起的作用是什么？细胞骨架的观察