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细胞生物学第九、十章教案第九章细胞增殖及其调控第一节细胞周期与细胞分裂一、细胞周期和分期1．细胞周期(cellcycle)指细胞一次分裂结束到下一个分裂终止所经历过的过程；具体地说，就是经细胞分裂产生的一个新细胞生长增大，尔后又均等分为两个与原细胞相同的子细胞，这种生长与分裂的周期变化就叫细胞周期。DNA合成前期（G1期）休止期（G0期）DNA复制合成期（S期）末期(e)、后期(d)、中期(c)、前中期（b）、前期(a)DNA合成后期（G2期）根据细胞核和细胞质在不同阶段的生理状况，可将细胞周期分为分裂期(M期)和分裂间期；分裂间期包括G1、G0、S、G2等四个时期。G1期——DNA合成期。细胞一旦完成分裂，即进入G1期。它是决定细胞是否继续通过另一个周期或停留在G1期而变成分化细胞的一个决定瞬间。G0期——休止期。分裂结束后，细胞处于暂时休止状态，只有当它们受到刺激后才开始进?蠨NA合成和细胞分裂。S期——DNA复制合成期。在细胞核里，此期初始阶段为常染色质复制．后期阶段为异染色质复制。G2期——DNA合成后期。是细胞进入分裂期的启动阶段。M期——细胞分裂期(D期)是从染色体凝缩、分离到平均分配到两个子细胞为止的时期。又可依次分为前期、前中期、中期、后期和末期。(a--前期。染色质浓缩，在核内表现出一定的散布形式。b--前中期或早中期。细胞核膜消失，分裂中心移动并到达两极。c--中期。当染色体开始到达纺锤体赤道面时，标志着中期开始。此刻的细胞若经某些化学试剂处理，则可使染色体停留在此而进行细胞学研究。d--后期。染色体离开赤道面向两极移动，后期就开始了。e--末期。染色体解聚恢复成染色质状态，核膜、核仁重新出现)细胞周期的长短及其变化：不同种类生命有机体、同一种类不同系统、不同组织的细胞同源性很强。其细胞周期的时间(Tc)也不相同。细胞周期中tG1变化最大，往往由它决定Tc的长短，而tG2+tS+tM时间则相对稳定。细胞周期的测定:(1)体内外采用3H-TdR脉冲标记，定时取材，利用放射自显影方法，统计标记有丝分裂细胞百分数加以测定。从细胞增殖的角度看，细胞可分为三类：连续分裂的细胞（在细胞周期中连续运转，又称周期中细胞cyclingcell，如：小肠绒毛上皮腺窝细胞、表皮基底细胞、部分骨髓造血细胞等）、休眠细胞（暂时脱离细胞周期细胞、不进行增殖、但在适当的刺激条件下可重新进入细胞周期的细胞、如某些免疫淋巴细胞、肝、）肾及大部分骨髓干细胞等，也称作G0细胞）、终端分化细胞又称不分裂细胞（不可逆的脱离细胞周期，丧失分裂能力，但保持生理机能活动的细胞）。二、特异的细胞周期1.早期胚胎细胞的细胞周期早期胚胎细胞的G1期和G2期非常短，以至于人们认为早期胚胎细胞周期仅含有S期和M期。2.酵母细胞的细胞周期酵母细胞周期持续时间较短，约为90min。和许多高等细胞生物一样，细胞分裂过程属于封闭式，即在细胞分裂时，其他细胞核核膜不解聚。与细胞核分裂直接相关的纺锤体不是在细胞质中，而是位于细胞核内。3.植物细胞的细胞周期植物细胞的细胞周期与动物细胞的标准周期非常相似，也含有G1期，S期，G2期和M期四个时期。期明显特征有：（1）植物细胞不含中心体，但在细胞分裂时可以正常装配纺锤体。是什么因素控制纺锤体的形成一直是植物细胞周期研究领域重要课题；（2）植物细胞以形成中间板的形式进行细胞质分裂。4．细菌的细胞周期细菌的DNA为一环形分子，含有一个复制起始点（origin）。一般情况下，细菌生长缓慢，?贒NA复制之前，一般要经过一个临界时间（threshold），调节DNA复制的起始。在DNA复制之后和细胞分裂之前，也有一个临界时界。细菌细胞周期也基本具备4个时期。在快速生长的情况下，细菌细胞每分裂一次（即一个细胞周期时间）仅需要35min，而完成一次DNA复制却需要40min。而且在DNA复制之前，需要10min的复制起始准备，在DNA复制之后还需要20min的染色体分离和细胞分裂。所以真正完成一轮DNA复制实际需要70min。解决这一矛盾，细菌在上一次细胞分裂结束时，，细胞内的DNA已经复制一半路程。细菌分裂后，立即开始新一轮的DNA复制。10min后，DNA复制起始，复制的起点不是在一个DNA分子上，而是在两个正在形成中的DNA分子上同时开始。从一半路程到两个子细胞的形成，前后时间？35min。三、细胞同步化(synchronization)细胞同步化是指自然的或经人为选择或诱导选择造成的细胞周期同步化。前者指自然同步化，后者指人工同步化，大致可分为选择同步化和诱导同步化，或两者的结合。1选择同步化选择同步化主要是指有丝分裂同步法单层培养于培养器中细胞处于对数生长期，轻加震荡，M期细胞即脱离器皿而悬浮于培养液中，倾出培养液于4℃冰箱中保存。再加入新鲜培养液继续培养，经1－2小时，重复以上操作，可获得一定数量的M期细胞。优点：同步化程度高，转入37℃中培养即开始分裂；；缺点：分离细胞数量少，尤其是生化分析。2诱导同步化①DNA合成阻断法：选择DNA合成抑制剂可逆地抑制DNA的合成而不影晌其它各时期细胞沿细胞周期运转，细胞阻断在S期。G1/S-TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是最常用的方法[成对数增长的细胞培养基+过量的TdR(最终浓度达2．5mmol／L)细胞分裂被阻断于G1／S(此为第一次阻断)，移去TdR，洗涤细胞，+新鲜培养液(阻断因素解除，细胞沿周期继续前进，当释放时间tS时，所有细胞均脱离S期)+TdR(第二次阻断)，细胞再经过G2+M+G1的时间，细胞被阻断于G1／S交界的狭窄区段中。]这种方法只适用于(tG2+tG1+tM)tS的细胞。优点：同步化程度高，适用于任何培养系。图②中期阻断法某些药物可抑制微管的聚合，因而抑制有丝分裂器的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期。(此种方法可逆性差!)，中期阻断药物最常用者为秋水仙素或秋水仙素酰胺。四、细胞周期的时相及其主要事件细胞周期沿着G1—S—G2—M的顺序进行，不同时期出现不同的关键性事件。S期：①DNA合成(DNA合成保持原核生物的半保留复制方式，冈崎片段复制的特点，复制叉的生长方式，RNA引物的参与等。一般说来，S期中常染色质复制较早，异染色质复制较晚?期中早期复制的DNAGC含量较高：晚期复制的DNAAT含量较高)；②与DNA合成相关的一些酶活性出现高峰：⑧组蛋白表达出现峰值(组蛋白用于核小体的组装。DNA的合成与组蛋白的合成强度保持时间上的同步，密度上的相应，而使新合成的DNA得以及时包装成核小体，二者保持一种联动关系。)。S期激活因子：G1进入S期与S期的激活因子有关。近几年，基本弄清了S期的激活因子的分子性质，称之为SPF(Sphasepromotingfactor)即促S期因子。[通过S期细胞和G1，G2及Gl和G2期细胞融合，?证明—个细胞周期DNA只能合成一次]早G1、晚S及G2期：出现上千个相同和不同的蛋白质(研究方法：①同步化细胞；②双向凝胶电泳；③放射性氚标记的混合氨基酸；④放射性自显影)。M期：存在一钟盏既旧誓囊蜃樱弥治镏食莆兴糠至岩蜃?MF)，也称MPF(maturationpromotingfactor)。[Johnson和Rao(1970)利用G1，S及G2期细胞与M期细胞融合，发现了形态各异的染色质凝集，称之为早熟染色质凝集(prematurechromosomecondensation)，简称PCC]。cdc基因(celldivisioncyclegenes)：与细胞分裂的有关基因。该基因的有序表达，是受到一些控制点调控和监视的。[a．酵母，DNA合成稍前有启动点(start)；b-哺乳类，R点或限制点(restrictionpoint)或称检验点(checkpoint)也叫G1／S转换点(S启动点)。另外还有G2／M检验点、中期/后期转换处的检验点(酵母中至少有6个检验点)。[DNA损伤未修复之前不能进入S期；S期DNA合成来完成之前不能进入M期；M期纺锤俸和染色体连接不良则不能进入后期]。若没有这套监视系统，便会产生断裂的染色体、异倍体或基因丢失而造成细胞遗传上的紊乱，不是导致癌变，就是导致死亡。图五、有丝分裂细胞分裂是个体生长和生命延续的基本保证。细胞分裂经过长期的生物演化过程由简单而逐渐臻于完善。细胞分裂celldivision：细胞通过一分为二方式产生子细胞的过程。有性生物的细胞分裂方式主要是生长时的有丝分裂以及生殖细胞成熟时的减数分裂。原核细胞—直接裂殖(directdivision)；真核生物—无丝分裂(amitosis)(也称直接分裂)、有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。[真核细胞的无丝分裂是正常的还是病理的分裂，一直有不同的观点。有人认为是一种生理适应。]1．有丝分裂的特征是有丝分裂器(mitoticapparatus)的产生。有丝分裂器系指有丝分裂时有微管(及其结合蛋白)所组成的星体(aster)和纺锤体(spindle)。星体是指围绕中心体(eentrosome)向外辐射的微管。纺锤体是由大量微管在赤道面垂直捧列组成的中部宽阔，两极缩小的细胞器，形如纺锤。纺锤体由连续微管(continuousmicrotubulcs)[连续微管由一极通向另—极．但绝大多数并非真正连续．而是来自两极的微蕾在赤道面(equatorialplane)彼此相搭，侧面结合。动力微管(kinotochoremicrombles)[动力微管是指一端由极部发出，另一端结合到动力上的微管。]及区间微管(interzonalmicrotubules)[区间微管是指在后期和末期时连接已经分向两板的染色，体或子核的微蕾。]组成。[有丝分裂器在维持染色体平衡，运动、分配中起着重要的作用。]2．有丝分裂中的两个重要的细胞器—中心粒（centroile）和动粒（kinetochore）1)中心粒①结构：中心粒的结构通常是呈盲倒的圆筒状小体，d，0．25微米，长度不定，位于临近核膜的细胞质中，筒壁为9组大约呈30度倾斜排列的三联微管组成。在一对中心粒的周围是一团透明的电子密度高的中心粒周围物质(PCM)，这一复合物称为中心体。②中心粒的成熟：G1期细胞有一对互相垂直的中心粒；S期两个中心粒稍有分离，在距母中心粒的一定距离(约5～60纳米)处，与其垂直的方向复制出一个子中心粒；G，晚期到M早期子中心粒不断长大，逐渐分离，移到两极的中心粒形成晕，并组织纺锤体和星体；M'末期，每个子细胞各获得一对中心粒，一个母中心粒和一个子中心粒。2）动粒动粒又称着丝点是细胞分裂的重要细胞器，是有丝分裂时纺锤体微管附着于染色体的部位。后期时动粒微管变短，将两条染色单体拉向两极。[在光镜时代，动粒又称着丝粒(centromere).细胞学家多用动粒—词。在电镜发现中期染色体主缢痕外侧有—附加的3层结构，称为动粒。动粒的3层结构外层覆盖有纤维状物质组成的冠(croha)．3层结构中主要是蛋白质，其中有少量的DNA和RNA。用免疫印迹法研究动粒蛋?證ENP(CENtromereProtein)的分子量，发现不间动物种类，不周发育阶段、不同细胞周期有所差异。但在多种动、植物中有其同源性．表明在进化上有高度保守性。遗传学家多用着丝粒一词，着丝粒是染色体主缢痕中比较宽阔的区域．(动粒与其平行排列)．着丝粒是由富含重复序列的DNA异染色质所组成．与其它染色质的不同处在于它的高度浓缩，对低渗膨胀和核酸酶消化有抗性。]动粒/着丝粒区域总称为着丝粒结构域(centromeredomain)，由三个结构域构成：动粒结构域(kinetotromeredomain)[包括三层板结构和外侧的冠，在此域发现有微管蛋白、钙调素(CaM)、动力蛋白、p34cdc2以及糖酵解的稀醇酶等，可能与染色体的运动有关。]、中心结构域(centraldomain)[代表着丝粒的区域]及配对结构域(pairingdomain)[沿着中心域结构的内表面分布，是姐妹染色单体中期相互作用的部位。此结构域有两