细胞组分的分离与鉴定

实验六细胞组分的分离与鉴定一、实验目的了解用细胞匀浆和差速离心的方法分级分离细胞组分的原理及过程。熟悉离心机、匀浆器的使用方法。二、实验内容㈠实验原理细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。此法是通过组织细胞匀浆、分级分离（密度梯度离心或差速离心）和分析三个步骤完成的。在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核蛋白体。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀1.差速离心（differentialcentrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。2.密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)㈡实验方法1.处死家兔：耳缘静脉空气栓塞法2.制备肝细胞匀浆:家兔处死后，立即剖腹取肝，迅速浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。按每克肝重加9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液匀浆化。（20g×9ml/g=180ml）用八层纱布（先用少量蔗糖液湿润），过滤匀浆液于烧杯中。制备一张滤液涂片，做好标记，自然干燥。每组取10ml滤液，3000r/min离心10min，制备一张上清液涂片，做好标记，自然干燥。吸去上清，用10ml0.25mol/L蔗糖液悬浮沉淀物，用吸管混匀，配平后以3000r/min离心10min。吸去上清液，加入0.5ml蔗糖溶液，用吸管吹打成悬液，制备一张涂片，做好标记，自然干燥。3.差速离心法分离细胞器低速离心分离细胞核高速离心分离线粒体4.分析将干燥后的三张涂片浸入95%乙醇5min，晾干。在涂膜部分滴加数滴甲基绿-派洛宁染液染色20min，再以纯丙酮分化20s，蒸馏水漂洗，直立于吸水纸上吸干水分。在高倍显微镜下比较观察三张涂片。细胞核被染成蓝绿色，核仁和细胞碎片染成淡红色。