细胞色素c的制备与相对分子质量的测定

1细胞色素c的制备与相对分子质量的测定钟日龙(2009316044)赵炀（山西大学生命科学学院山西太原市坞城路92号邮编：030006）摘要氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C在415nm、520nm和550nm有最大吸收峰。550nm处的磨尔消光系数为2.77×l04moL/m。其中还原型最稳定，实验中所获得的细胞色素产品是氧化型和还原型的混合物。经氧化剂或还原剂处理，可变为单一种型。测定其中一种的光吸收，根据磨尔消光系数，即可计算出细胞色素C的含量。根据生物大分子所带电荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量关键词细胞色素C制备相对分子质量电泳法测定中国分类号：文献识别码：文章编号：PreparationofcytochromecandmolecularweightdeterminationZhongRiLong(2009316044)ZhaoYang(CollegeofLifeScience,ShanxiUniversityTaiyuan,ShanxiProvinceNo.92DockRoad,CityZip:030006)SummaryofoxidizedcytochromeCinthe408nm,530nmmaximumabsorptionpeakofreducedcytochromeCat415nm,520nmand550nmabsorptionmaximum.Seoulmillat550nmextinctioncoefficient2.77×l04moL/m.Whichisalsothemoststableprototypeexperimentintheproductobtainedisoxidizedcytochromeandalsotheprototypeofthemixture.Byoxidizingorreducingagenttreatment,intoonesingletype.Onemeasurementoflightabsorption,extinctioncoefficientbasedongrindingSeoul,youcancalculatethecytochromeCcontent.AccordingtothechargeofbiologicalmacromoleculesamountandsizeofthedifferentrarediseasesusingSDS-polyamineacidgelelectrophoresisofcytochromeC,molecularweightKeywordscytochromeCpreparationelectrophoresisfordeterminationofmolecularweight正文1.前言细胞色素C是有效的电子传递体，对因组织缺氧引起的一系列症状，起到矫正细胞呼吸与物质代谢作用。临床上细胞色素C主要用于治疗因组织氧化还原过程障碍及因组织缺氧所引起的一系列疾病，如改善脑血管障碍、脑出血、脑外伤、脑动脉硬化、脑栓塞、中风后遗症等引起的氧缺乏等症状；治疗一氧化碳中毒、催眠剂中毒、新生儿假死、视神经症以2及因心脏代谢障碍、心绞痛引起的心肌组织缺氧等。也可应用细胞色素C治疗因支气管哮喘和慢性肺炎所致的肺功能不全。有报道对进行性肌肉萎缩症也有较好疗效。其肠溶衣口服片对放疗和化疗引起的白细胞降低等也有改善作用。细胞色素是只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C(cytochromec)是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，耐热、酸碱，不易变性。细胞色素C，相对分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性溶液中提取。其制品分为氧化型和还原型两种，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起失活。吸附剂通常在微酸性(pH5~6)或低盐溶掖中吸附蛋白质。吸附于吸附剂上的蛋白质在微碱性或较高改浓度条件下即可洗脱下来。还原型细胞色素C波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性作出一条标准细胞色素C浓度和对应的光密度值的标准曲线，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。根据生物大分子所带电荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量。细胞色素C在动物心肌和酵母中含量丰富，可作为实验材料。所以本实验以新鲜猪心脏为材料。2.实验部分2．1主要实验器材与试剂绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l型分光光度计；玻璃柱(2.5×30cm)；下口瓶；烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋沸石（80目）滤纸三恒电泳仪垂直平板电泳槽移液器烧杯直尺2MH2SO4溶液；1MNH4OH溶液；固体硫酸铵25％硫酸铵溶液:100m1蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度0.2％氯化钠溶液：称0.2克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.BaCl2试剂：称12克BaCl2,溶于100ml蒸馏水中。20％三氯醋酸溶液联二亚硫酸钠(Na2S2O4·2H2O)凝胶贮液分离胶缓冲液10%SDS浓缩胶缓冲溶液样品缓冲液电移缓冲液低相对分子质量标准蛋白染色液脱色液10%过硫酸铵待测维生素C样品2.2试验方法2.2.1实验原理向心肌中加入三氯乙酸溶液，进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则留在三氯乙酸溶液中。将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍留于溶液中。再用乙酸乙酯酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。鉴定及测定细胞色素C用消光法。在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9×104/克分子/厘米还原型细胞色素C：K2=2.77×104/克分子/厘米其含义为浓度是1克分子/升或1毫克分子/毫升的氧化型细胞色素C溶液，通过1厘米3的光程，其消光值为0.9×104。样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者从还原型转变成氧化型，消光值相同。若样品不纯，含有其他色素，则测得的变化不可靠。【3】本实验细胞色素C的产率＞50mg/公斤，蛋白质的含量＞0.5mg/mL，则实验成功。2.2.2试验流程材料处理-提取-中和-吸附与洗脱-三氯醋酸沉淀-透析-鉴定-测定2.3实验操作2.3.1细胞色素C的制备⑴材料处理取新鲜猪心，用水洗去积血，除去脂肪和韧带，将猪心切成小块，放入组织捣碎机，加入2倍体积的蒸馏水，绞碎。⑵提取用1MH2S04调pH至3.8(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在即将提取完毕，停止搅拌之前，以2M氨水调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。按同样程序处理滤渣，合并两次提取液。⑶中和用2mol/L氨水将提取液调至pH7.5(此时，等电点接近7.5的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，冰浴中静置30～40分钟中后过滤，收集滤液。⑷吸附与洗脱①人造沸石的预处理：称取人造沸石（每升提取液约需80目沸石10克)，放入烧杯中，加水搅拌，除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。②装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将已处理好的人造沸石带水装填入柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。③上样：柱装好后，打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的提取通过人造沸石柱进行吸附。柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。④洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用0.2％NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。⑤人造沸石再生：将使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.25M氢氧化钠和lM氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，前后用蒸馏水反复洗至pH7～8，即可重新使用。⑸盐析为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵(按每l00m1洗脱液加入20克固体硫酸铵的比例)边加边搅拌，放置30分钟后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸(或离心)除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。(6)三氯醋酸沉淀在搅拌情况下向所得透亮溶液中加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1细胞色素C溶液)，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性)，立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。⑺透析将沉淀的细胞色素C溶解于少量的蒸馏水后，装入透析袋，在500m1烧杯中对蒸馏水4进行透析除盐(电磁搅拌器搅拌)，15分钟换水—次，换水3至4次后；检查透析外液SO42-是否已被除净。检查方法：取2m1BaCl2溶液于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，反之，说明透析完全，将透析液过滤，即得细胞色素C制品。2鉴定取制品与CBB试剂反应，观察颜色变化。2.3.2细胞色素c的定量测定样品测定取1ml样品，稀释适当倍数，再加少许联二亚硫酸钠，在波长520nm处测定光密度。最后根据标准曲线的斜率计算其细胞色素C的含量。2.3.3相对分子质量的测定2.3.3.1将垂直电泳槽装好，用15%琼脂趁热灌制于电泳槽平板玻璃的底部，以防漏。2.3.3.2分离胶的选择和配置方法（1）按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同的分离胶(2)不同分离胶的配置方法2.3.3.3分离胶的灌制根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用血管内皮细胞生长因子（VEGF）为待测相对分子质量的样品，用12%的分离胶。在15ml试管中依次加入重蒸水3.35ml，1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)/ml缓冲液2.5ml,10%SDS/mL,凝胶贮备液4.0ml,10%过硫酸铵50ul和TEMED5ul,由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，实验应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩液。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30到60分钟，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。2.3.3.4浓缩胶的配置与灌制蛋白质相对分子质量的范围分离胶的浓度10^420%-30%1*10^4-4*10^415%-20%4*10^4-1*10^510%-15%1*10^4-5*10^55%-10%5*10^52%-5%分离胶的浓度20%15%12%10%7.5%重蒸水1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)/ml质量浓度10%SDS/mL凝胶贮备液（Acr/Bis）/ml量浓度为10%过硫酸铵、ulTEMED/ul总体积、ml0.752.50.16.6505102.352.50.15.0505103.352.50.14.0505104.052.50.13.3505104.852.50.12.5505105一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水2。92ml,0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8)1.25ml,10%SDS0.05ml,凝胶贮备液（Acr/Bis）0.8ml,10%过硫酸铵25ul,TEMED5ul,在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将