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QPCR实验过程一、细胞培养1.1不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。1.2凝胶样品的灭菌处理将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。1.2水凝胶样品的接板将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。二、PCR操作过程2.1M-RNA的提取2.1细胞裂解将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80℃的冰箱中至少冷冻12小时。2.2M-RNA提取2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。然后2-8℃，12000*g离心15min。离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。2.2.2把水相转移到1.5mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500µl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。然后向离心管中加入每1mlTRzol加入0.5ml的异丙醇，在冰上放置10min。2.2.3剧烈混匀后2-8℃，12000*g离心10min，离心前看不到RNA沉淀，离心后可能也看不到，属于正常现象。剧烈磕去上清液。2.2.4加入75%的乙醇洗涤RNA。没1mlTRzol加入1ml75%乙醇。2-8℃，不超过7500*g离心5分钟，用力磕去上清液，然后在冰面上进行干燥30min.2.2.5加入40µl的DEP水进行稀释，然后混匀，离心后备用。若不立即使用可以存放在-80℃。三、逆转录操作过程本逆转录过程使用的是ThermoScientific的K1622试剂盒。3.1按照操作说明书预先配好逆转录试剂前驱液（每个样品用量）（1）加入引物为RandomHexamer:1µl（2）加入5XReactionBuffer:4µl（3）加入RiboLockRNaseInhibitor(20U/µl):1µl（4）加入10mMdNTPMiX:2µl（5）加入RevertAidM-MulVRT(200U/µl):1µl（6）加入Water，nulease-free:3µl（7）加入TemplateRNA:8µl1-6步骤可以多个样品同时配好，在分装。以上所有物质加在一起共20µl反应体系。（也可以参考试剂盒说明书）3.2逆转录过程及程序设计将3.1步的所有样品加入PCR小管子中，然后涡旋震荡30s，再用小离心机离心30s.然后将其放到PCR仪器中。3.3逆转录程序设置第一步：在25℃保温5min，然后在42℃保温60min，最后在70℃反应5min。（参照试剂盒说明书）3.4逆转录完成后取出样品，如不立即使用放置在-80℃。四、RT-PCR操作过程4.1反应体系配置具体配比按照下表（单个样品）：试剂名称使用量BestarSybrGreenqPCRmastermix10µl12.5µl25µlPCRForwardPrimer(10µM)0.5µl0.5µl1µlPCRReversePrimer(10µM)0.5µl0.5µl1µlDNA模板1µl1µl2µlddH2O8.0µl10.5µl21µlTotal20µl25µl50µl总反应体系选择为20µl，由于样品较多，为了省时间和方便添加试剂，可以分为三步走的方法。首先配置所有样品所需要的荧光染液，其次配置不同引物的各自总含量，最后加入所需要的CDNA含量。（我实验选择的为20µl）4.2实验的布板将上述三种试剂加到PCR专用孔板中，然后封膜，不能有气泡。最后进行涡旋混匀30s，然后利用孔板离心机离心30s。具体样品布板说明案例，以4个样品，每个样品三个平行样，每个平行样分出两个样。共检测5个基因，一个内参基因。具体布板如下图SampleGene1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-3CollagenCollagenALPALPOCNOCNGAPDGAPDSampleGene1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-3OPNOPNRUNRUNGAPDGAPD注意，加样品时要非常小心，避免出错，且孔板要在冰上，内参基因每个板子单独存在。4.3三步法PCR扩增标准程序预变性95℃，2min；PCR反应95℃，10s;50-60℃，30-34s;40cycles72℃，30s；溶解曲线（判断特异性）95℃，1min；55℃，1min；55-98℃(10sec/cycle0.5℃/cycle)86cycles。五、仪器操作开机：先开电脑，然后开启PCR仪器电源，带出现DNA分子链，按PCR仪器中间按钮立刻打开舱门。然后开启相应程序，逆转录按照程序进行即可。PCR过程操作：打开程序后，确认参数，然后点击下一步；点击create，选择板子，在sample位置选择Unknow，然后选择带有样品的板子（可以直接全选），最后对孔板进行命名，分为横向样品名称和纵向基因名称，然后保存程序文件，点击运行，保存数据文件位置，然后开始PCR扩增程序，预计等待2-3个小时，结束实验，取出样品。六、结果分析反应结束后确认PCR的扩增曲线和溶解曲线，进行PCR定量分析。七、实验注意事项7.1安全性主要实验使用的Trizol，氯仿、异丙醇、荧光染料等具有一定的挥发性和毒性，要戴手套和口罩，以及在通风橱下操作。7.2实验耗材注意本实验的所用的枪头，离心管必须经过灭菌处理，防止存在细菌和酶的存在。所使用的水均为专用的无酶水。7.3RNA的降解防护RNA室温极易降解，所有关于RNA的操作必须在冰上进行，且所有用到的实际必须在冰箱或者冰上降温后使用。实验操作尽量快速进行。