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基因工程[最新考纲]1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.实验：DNA的粗提取与鉴定。考点一基因工程的基本工具及操作过程1.基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(限制酶)①来源：主要从生物中分离纯化而来。②作用：识别并切开特定部位的两个核苷酸之间的。③结果：产生或平末端。原核特定的核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是，切割位点在之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是，切割位点在之间；说明限制酶具有。GAATTCG和ACCCGGGG和C专一性(2)DNA连接酶①作用：将限制酶切割下来的DNA片段。②类型常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源__________T4噬菌体功能只“缝合”__________“缝合”____________________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的___________拼接成DNA分子大肠杆菌黏性末端黏性末端和平末端磷酸二酯键(3)载体②其他载体：λ噬菌体衍生物、等。③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。双链环状DNA分子限制酶切割位点标记基因动植物病毒(1)基因工程2种工具酶的化学本质分别是什么？运载体的种类有哪些？提示限制酶、DNA连接酶其化学本质均为蛋白质。运载体的种类有质粒(常用)、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。(2)限制酶为何不切割自身DNA?提示限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是↓—CAATTG—和↓—GAATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。提示适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。2.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取①目的基因：主要指的基因，也可以是一些具作用的因子。编码蛋白质调控基因文库mRNA反转录DNA合成仪(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心①目的：使目的基因，同时使目的基因能够表达和发挥作用。②基因表达载体的组成在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代RNA聚合酶转录转录目的基因③构建过程(3)将目的基因导入受体细胞受体细胞种类不同，导入方法不同同种限制酶DNA连接生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法_______________________________________受体细胞体细胞或受精卵_____________原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子农杆菌转化法显微注射法转化法受精卵(4)目的基因的检测与鉴定1.下列物质或过程哪一项不影响磷酸二酯键数目变化？请逐项分析说明。①RNA聚合酶、逆转录酶、Taq酶②DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA酶③遗传信息的翻译、PCR中DNA解链④cDNA文库的构建、基因突变过程提示③RNA聚合酶、逆转录酶和Taq酶的作用都会导致磷酸二酯键的数量增加，DNA聚合酶和DNA连接酶的作用都会导致磷酸二酯键的数量增加，而DNA酶的作用会导致磷酸二酯键的数量减小，遗传信息的翻译会增加肽键的数目，PCR中DNA解链会减少氢键的数目，这两个过程都不会影响磷酸二酯键的数目，cDNA文库的构建需要使用逆转录酶，这会导致磷酸二酯键数目增加，基因突变是指基因中碱基对的增添、缺失和替换，其中增添和缺失会导致磷酸二酯键数目改变。2.(教材P4“寻根问底”改编)根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？提示原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。3.(教材P6“旁栏思考题”解答)想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？提示能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等。1.(2016·全国课标卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且________和________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于____________________________________。解析(1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具1或多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。答案(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞2.如图为农杆菌转化法示意图。请回答以下问题：(1)图中①过程用到的工具酶的特点是________________(2)图中②过程用到的工具酶是____________，该过程是基因工程最核心的步骤，即____________。(3)图中③过程，需使用________溶液处理农杆菌使其成为感受态。(4)图中④过程的原理是____________。(5)检测基因工程是否成功。首先，应检测_________________，这是目的基因能否在真核细胞内稳定遗传的关键；其次，利用____________法检测目的基因是否转录出相应的mRNA；最后，利用____________法检测目的基因是否翻译成蛋白质。答案(1)能识别特定的脱氧核苷酸序列并且在特定位点切开DNA分子(2)DNA连接酶基因表达载体的构建(3)氯化钙(4)植物细胞的全能性(5)转基因生物的染色体上是否插入目的基因分子杂交抗原—抗体杂交(1)诠释基因组文库与部分基因文库(2)诠释PCR技术①原理：体外DNA复制②需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)③过程：DNA受热(90～95℃)变性解旋为单链、冷却(55～60℃)后RNA引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸(70～75℃)合成互补链。(3)诠释基因表达载体(4)农杆菌转化法原理植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，则目的基因将被一起带入)考点二基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高动物从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产；用转基因动物作器官移植的等。(2)植物基因工程：培育转基因植物(如抗虫棉)、______转基因植物(如转基因烟草)和转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的(如新花色矮牵牛)。生长速度药物供体抗虫抗病抗逆品质(3)比较基因治疗与基因诊断：原理操作过程进展基因治疗____________利用__________导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断____________制作特定__________与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用基因表达正常基因碱基互补配对DNA探针2.蛋白质工程(1)概念理解①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。②操作：或基因合成。③结果：现有蛋白质或制造出。④目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对进行分子设计。基因修饰改造了新的蛋白质蛋白质结构(2)操作过程从预期的蛋白质出发→设计预期的→推测应有的→找到相对应的(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。其流程图如下：功能蛋白质结构氨基酸序列脱氧核苷酸序列1.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？提示基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。2.(教材P26旁栏思考题解答)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？提示毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：(1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。(2)对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。1.(2015·全国卷Ⅱ，40)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：______________________________________________________________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_____________