维生素B6对史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性的影响

维生素B6对史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性的影响*邢浩春1,李同庆2,杜利强3,安瑞永4（1.邯郸学院生物科学系，河北邯郸056003；2.河北省水产局，河北石家庄050011；3.河北科技师范学院生命科学系，河北昌黎066004；4.河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050016）摘要：首次报道了饲料中维生素B6对史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性的影响。在温度为（20±0.5℃）、pH值为6.8-7.5的条件下研究了低蛋白含量（28％）饲料中添加不同水平的维生素B6（0、15、30、45、60、75mg/kg）对史氏鲟(Acipenserschrenki)幼鱼（34.07g±3.44g）胰蛋白酶活性的影响。结果表明饲料中的维生素B6添加量为45mg/kg-60mg/kg时对幼鲟胰蛋白酶的激活作用最大，并可相应提高对饲料蛋白质的消化率。关键词：史氏鲟（Acipenserschrencki）；维生素B6；胰蛋白酶活性；饲料蛋白质消化率中图分类号S963.16文献标识码AEffectofDietaryVitaminB6onTrypsinActivityforjuvenileAcipenserschrenckiBrandtXINGHaochun1,ANRuiyong2,LITongqing3,DULiqiang4(1.BiologyDepartment,HandanCollege,HebeiHandan0560012.BureauofAquaticProductsofHebeiProvince,HebeiShijiazhuang0500163.ScienceLifeDepartment,HebeiNormalUniversityofScience&Technology,HebeiChangli0660044.CollegeofLifeScience，HebeiNormalUniversity，HebeiShijiazhuang050016)AbstractInthispaper,theeffectofdietaryVB6ontrypticactivityforinfantAcipenserschrenkiBrandtwasfirstreported.Undertheconditionsoftemperatureat（20±0.5℃）andpHof6.8-7.5,theeffectofaddingVB6withdifferentlevels（0,15,30,45,60,75mg/kg）infeedwithlowerprotein(28%)ontrypsinactivityforjuvenileA.schrenkiBrandt.Theresultshowedthatactivationoftrypticactivitywasthehighestattherangeof45mg/kgto60mg/kgconcentrationforinfantA.schrenkiBrandt,andproteindigestibilityratioaccordinglywasincreased.KeywordsAcipenserschrenki,VitaminB6,Trypsinactivity,Proteindigestibilityindiets*基金项目：本研究由国家科技成果重点推广计划（2001EC000054）基金资助作者简介：邢浩春（1980—），女，山东聊城人，研究生，讲师，主要从事水产动物营养方面研究通讯作者：安瑞永（1962--），男，河北石家庄人，河北师范大学生命科学学院教授，水产动物营养与饲料史氏鲟（AcipenserschrenckiBrandt）是一种古老的软骨硬鳞鱼类，其体大味美，营养丰富，具有重要的食用和养殖价值。近年来，国内鲟鱼的养殖技术逐渐成熟[1]，产量越来越大，鲟鱼营养需求和饲料的研发成为当前水产饲料的主要研究内容之一[2]。但我国鲟鱼专用饲料的研制开发与国外相比起步较晚，与其它经济鱼类如鲤、罗非鱼等的饲料相比也比较滞后[3]。维生素作为重要的饲料添加剂在提高鱼类和水产动物对蛋白质的转化效率、促进生长发育和健康上有重要的作用[4-6]。关于鲟对维生素需求的研究开展的较少，目前主要对维生素A、C和E的营养需求及胆碱的最适量[7-12]进行了报道。有关B族维生素对鲟类生长发育和生理生化的影响及需求量方面的研究还是空白。而维生素B6与蛋白质和氨基酸代谢密切相关，在催化氨基酸的分解与合成中发挥重要的作用，是水产养殖饲料中必不可少的添加剂之一[13]。本文就饲料中不同水平的维生素B6对史氏鲟幼鱼胰蛋白酶分泌活性的影响和蛋白质消化率方面进行初步探讨，以期对史氏鲟配合饲料开发应用及人工养殖提供参考。1材料与方法1.1材料试验所用史氏鲟（Aeipenserschrencki）购自北京水产科学研究院，规格整齐、健康无病。水族箱中驯养20天，期间每日定时定量投喂人工饲料3次（8:00、14:00、20:00），残饵及粪便于下次投喂前吸出，养殖用水为生石灰消毒、沉淀、曝气48h的自来水。试验基础料参照陈声栋[14]和本实验室李同庆[15]对史氏鲟的试验配方自制成28%蛋白质水平的配合饲料，其主要原料组成见表1。基础料中分别单独加入0、15、30、45、60、75mg/kg的维生素B6(参照冷水鱼对维生素B6的需求量[16-17]），以等级放大法与基础料均匀混合，然后再用此法分别加入1%的Cr2O3外源指示剂混匀，最后用软颗粒机制粒后风干，制成6种不同维生素B6添加量（mg/kg）的史氏鲟试验颗粒饲料。表1基础料的主要原料组成（%）Table1.Formulationcompositionofthebasalfeeds(%)主要原料百分含量（%）主要原料百分含量（%）小麦麸15.0菜籽粕6.30鱼粉19.0膨化大豆15.0棉籽粕5.00玉米油3.30啤酒酵母5.00α-淀粉18.0羧甲基纤维素0.50Cr2O31.00添加剂（不含VB6）2.00其它9.901.2方法1.2.1史氏鲟养殖驯化结束后停食24h，选个体相近平均体重为（34.07g±3.44g）的史氏鲟幼鱼随机分为六组，每组六个平行，每个平行3尾，以随机化区组配置法进行编号，每日定时定量投喂含六种不同水平维生素B6的饲料，历时70d。养殖水温控制在（20±0.5℃）；pH值6.8-7.5；气泵定时充气使水中溶氧达6mg/L以上，每日换水量为30%；室内光源为3盏25W白炽灯，均匀布置以保证室内光线均匀，光制为14L:10D。试验初随机抽取5尾鱼作为开始时鱼体化学分析的材料。试验结束时，解剖分离新鲜成形的胰脏用锡纸包扎置于-80℃低温冰箱中保存。1.2.2胰蛋白酶活性测定参考张龙翔等[18]的方法采用酪蛋白为底物测胰蛋白酶活力。取史氏鲟幼鱼胰脏，加5倍体积4℃预冷去离子水，在超声波冰浴匀浆，9000rpm，4℃离心30min，取上清得粗酶液。样品管：取粗酶液1ml，35℃±5℃水浴5min，加35℃预热的酪蛋白溶液3ml，水浴中准确反应20min，然后加5％三氯乙酸3ml终止反应。空白管：取粗酶液1ml，35℃±5℃水浴5min，加5％三氯乙酸3ml，水浴中准确反应20min，然后加35℃预热的酪蛋白溶液3ml。样品管与空白管均在9000rpm下离心20min，取上清。用UV-8500型紫外-可见分光光度计于280nm处测其O.D值。1.2.3饲料蛋白质消化率测定采用二苯胺基脲比色法测定指示剂Cr2O3含量；采用半自动微量凯氏定氮法测粗蛋白含量（UDK126ASteamdistillingunit凯氏定氮仪，TitratorTitroLine96微量滴定装置(精度0.01ml)）。以上每个样品重复测3次，若相对偏差大于2%，则增加重复数，采用相对偏差小于2%的3个测定值的平均数为测定结果。1.2.4检测指标及计算公式酶活性指标：酶活性＝O.D./t表示反应20min后所测得的O.D.值蛋白质表观消化率=[1-（饲料Cr2O3含量/粪便Cr2O3含量）×(粪便中蛋白质含量/饲料中蛋白质含量)]×100%1.2.5数据处理方法所有实验数据均采用Statistica统计软件处理和绘制图表。首先进行方差分析，显著性水平取0.05，再进行Newman-Keulstest多重比较。2结果与讨论2.1维生素B6对史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性的影响胰蛋白酶是蛋白水解酶的一种，在脊椎动物中作为肽链内切酶，能选择性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制性分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。增强胰蛋白酶活性可以促进动物的消化吸收，提高饲料利用率，保证水产动物发挥最大的生产性能。表2维生素B6的添加量(mg/kg)对史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性和蛋白质消化率的影响（均值±标准差）Table2.TheeffectofvitaminB6contentonactivitiesoftrypsininsilverforjuvenileAcipenserschrencki(M±S.D.)维生素B6(mg/kg)01530456075胰蛋白酶活性(O.D)0.28±0.01d0.31±0.01d0.42±0.03c0.61±0.03a0.52±0.05b0.33±0.01d蛋白质消化率（%）74.47±2.32d77.11±1.88c79.49±1.01b83.18±0.91a83.00±1.62a76.96±1.54c*各值后的上标字母表示Newman-Keals检验结果，不同字母表示不同饲料组间有显著差异(p0.05)。y=(0.2744446)+(-0.003377286)*x+(0.0004624708)*x**2+(-5.456386e-006)*x**3维生素B6添加量（mg/kg）胰蛋白酶活性单位0.20.30.40.50.60.710203040506070方差分析表明（见表2），史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性在不同维生素B6添加组间有显著差异。Newman-Keuls多重比较表明，维生素B6添加量为45mg/kg、60mg/kg的饲料组胰蛋白酶活性显著高于其它组，而这两者之间没有显著差异。回归分析显示（见图1），饲料维生素B6的含量在0-75mg/kg范围内，维生素B6的添加量同幼鲟的胰蛋白酶分泌活性呈显著的三次多项式曲线关系（P＝0.02256，R=0.9573，df=12）。随饲料维生素B6添加量的升高，幼鲟胰蛋白酶分泌活性明显升高，而随着饲料维生素B6添加量进一步升高，幼鲟胰蛋白酶分泌活性又显著降低。这与徐志昌等[19]、许实容等[20]对中国对虾的研究结果相似，在适宜添加范围内，随着饲料中维生素B6添加量的增加，类胰蛋白酶活性也随之增加，蛋白质消化率升高；维生素B6添加量缺乏或过量，则酶活性受抑止，阻碍对虾生长。说明添加适量的维生素B6亦有提高史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性的作用，但过量也会使酶活性受阻，限制胰蛋白酶的消化作用。图1维生素B6的添加量(mg/kg)与史氏鲟幼鱼胰蛋白酶活性的关系Figure1.TherelationshipbetweenvitaminB6levelsofdietsinjuvenileAcipenserschrenckiandactivitiesoftrypsininsilver2.2维生素B6对史氏鲟幼鱼蛋白质消化率的影响方差分析表明（见表2），不同维生素B6添加组史氏鲟幼鱼对饲料粗蛋白的消化率（F5,42=28.215，p=0.00000）达到极显著水平，添加量为30mg/kg-60mg/kg的饲料组幼鲟对饲料粗蛋白的消化率极显著高于对照组和其它组。麦康森[21]认为，在对虾饲料中添加维生素B6后对蛋白质的消化率从91.9％上升到93.6％，与本实验结果相似。但本实验也显示在0mg/kg-75mg/kg范围内随维生素B6添加量的增大，幼鲟对蛋白质的消化率呈先上升后下降的趋势（表2），说明添加适量的维生素B6有提高史氏鲟幼鱼