缺氧缺血对新生大鼠松果体AANAT基因表达和MLT合成的影响

1缺氧缺血对新生大鼠松果体AANAT基因表达和MLT合成的影响丁欣1，姜善雨2，冯星＊，何军3，孙斌1，朱雪明1(1．苏州大学附属儿童医院新生儿科，江苏苏州215003；2．无锡妇幼保健院儿科，江苏无锡214002；3．苏州大学第一附属医院江苏省血液病研究所，江苏苏州215006）摘要目的旨在了解缺氧缺血性脑损伤（HIBD）对松果体合成褪黑素功能的影响，探讨松果体功能改变在HIBD中的意义。方法采用60只7日龄SD大鼠随机分成HIBD模型组和假手术组，模型组按改良Levine法建立。然后用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和放免技术分别测定并比较缺氧缺血后0、6、12、24、48小时松果体中芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶（AANAT）mRNA的表达水平及血浆褪黑素（MLT）的浓度。结果1.松果体中AANATmRNA的表达在HIBD后6小时、12小时、24小时低于对应假手术组（P＜0.05或P＜0.01）；假手术组各时点之间AANATmRNA的表达水平无明显变化。2.血浆MLT在HIBD后12小时、24小时血浆MLT水平均低于对应假手术组；假手术组各时点之间MLT浓度水平无明显变化。结论HIBD早期松果体合成褪黑素的功能下降，下调AANAT的基因表达可能是其功能下降的“引擎”。降低了MLT的内源性保护作用可能参与早期HIBD的发病机制。作者简介：1。丁欣（1981-），女，四川眉山人，住院医师，医学硕士，从事儿科临床工作，研究方向为新生儿脑损伤。2．姜善雨（1974-），男，江苏东台人，副主任医师，医学硕士，从事儿科临床工作，研究方向为新生儿脑损伤。二者同为第一作者。资金来源：2关键词缺氧缺血性脑损伤；芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶;信使核糖核酸；褪黑素TheInfluencesofHIBDonPinealAANATmRNAandMelatoninLevelinNeonatalRatDINGXin1,JIANGShanyu2,FENGXing＊，HEJun3,SUNBin1，ZHUXueming1(1.DepartmentofPediatrics,Children’sHospitalAffiliatedtoSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215003,China;2.DepartmentofPediatrics,WuximaternalandChildHealthHospital,WuxiJiangsu214002,China;3.TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity;JiangsuInstituteofHematology;KeyLaboratoryofThrombosisandHemostasis;MinistryofHealth;Suzhou215006;China)AbstractObjectiveToelucidatetheinfluencesofHIBDonpinealmelatonin-syntheticfunctionandexplorethepossiblesignificanceofpinealfunctionalterationsinHIBD.Methods60seven-day-oldratswererandomlydividedinto2groups.Semi-quantitativeReverseTranscriptasePolymeraseChainReaction(RT-PCR)wasusedtomeasuremelatonin-syntheticenzymes—arylalkylamine-N-acetyltransferase(AANAT)mRNAexpressionsinpinealglandandRadioimmunoassay(RIA)forplasmamelatoninlevels.Results1.TheAANATmRNAamountsof6h,12h,24hafterHIBDwerelowerthanthatofcorrespondingsham-operatedgroups（P＜0.05或P＜0.01），andthatofallsham-operatedgroupswereverymuchalike;2.Theplasmamelatoninlevelsof12h,24hafterHIBDwerelowerthanthatofcorrespondingsham-operatedgroups.Themelatoninlevelsofallsham-operatedgroupsweresimilar;ConclusionsPinealmelatonin-syntheticfunctionisimpairedonearlyHIBDstage.Down-regulationofAANATgeneexpressionislikelythe“engine”.Knock-downofendogenousprotectiveprocessofMLTmaybeplaysapartinearlyHIBDpathogenicmechanism.Keywords:hypoxic-ischemicbraindamage;arylalkylamine-N-acetyltransferase;mRNA;melatonin新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE）是围产期窒息缺氧导致的缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD）性疾病，其存活者可遗留永久性神经系统后遗症，如脑瘫、智力低下、癫痫、语言障碍和共济失调等[1],严重影响患儿的生存质量。深入研究脑损伤的发病机制3对于选择合适的干预措施，减轻后遗症具有重要意义。褪黑素（melatonin,MLT）是松果体合成分泌的一种吲哚类激素，它除了具有镇静、抑制性腺、调整生物钟外，还有强大的清除氧自由基、抗氧化作用,以及保护DNA、膜脂质、线粒体免受氧化损伤[2]和维持神经胶质细胞功能。至今国内外尚无研究缺氧缺血性脑损伤与松果体功能关系的报道。我们实验小组在前期的实验中发现新生大鼠HIBD后松果体等神经细胞凋亡增加[3]，外源性MLT对缺氧缺血后皮质海马损伤有神经保护作用[4]，故我们期望在形态学基础上进一步观察新生大鼠HIBD后松果体细胞中AANATmRNA和血浆中MLT水平的变化，探讨松果体功能改变在HIBD中的意义，为MLT用于临床治疗HIE以及基因治疗HIE奠定基础。1、材料方法1.1实验动物采用无特定病原体（SpecificPathogenFree，SPF）7日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠，许可证SCXK（苏）2002-0008，雌雄不限，体重11-14g。在光照-黑暗（light-dark，LD）交替条件下饲养，由母鼠自由哺乳。动物房室温维持在25士2℃。LD光制采用LD(12:12)即12小时光照(光照期06:00-18:00)与12小时黑暗(黑暗期18:00-06:00)交替。1.2动物分组及处理60只新生大鼠随机分成2组，每组30只，分组如下：①HIBD模型组：在HIBD后第0、6、12、24、48小时设5个时间点，②假手术组（sham-operatedgroup）：时间点同上。制作模型时仅分离出左颈总动脉，不予结扎，缝合皮肤后放入相同恒温箱中饲养，不予低氧处理。模型制作参照改良Levine法[5]。选用7日龄新生SD大鼠，乙醚吸入麻醉，固定于手术板上，取仰卧位，在颈部正中作1cm左右的纵型切口，分离皮下组织和肌肉，在左侧胸锁乳突肌深面与气管之间找到并游离出左颈总动脉，以3-0号丝线双层永久性结扎，缝合切口。手术结束后将大鼠放在33℃暖箱中恢复1-2小时，然后进入事先置于33℃暖箱中的密闭常压低氧舱，给予湿化的8%氮氧混合气2小时，流量为2L/min，测氧仪监测氧浓度，模型制作完毕后回母鼠身边饲养。两组取材时间（HIBD后0小时为清晨0时，余推算）、地点、光线均相同；4取材时节：9-11月。血标本：采用眼球摘除法取血，每只幼崽取血约0.15-0.3ml，肝素法分离血浆，-20℃冰箱保存备用。1.3.1RT-PCR检测AANATmRNA表达采集松果体标本参照Kuszak[6]法摘除松果体。按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。逆转录后，采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定松果体中AANATmRNA的相对表达量。引物根据大鼠AANAT基因文库参照文献设计，上海生物工程技术有限公司合成。用UVIDoc成像分析系统软件测定电泳后各泳带灰度，与内参β-actin做比值半定分量析后进行统计。AANAT引物序列为：（预期产物443bp）:5′-TGAGCGCGAAGCCTTTATCTCAGT;3′-TGTGGCACCGTAAGGAACATTGCA1.3．2血浆MLT水平的检测血浆MLT水平用智能放免γ软件分析系统利用LOGIT-LOG回归法测定浓度。标准品，NSB管做双份平行实验。1.4统计学处理采用SPSS10.0医学统计软件。所有结果用均数±标准差（x±ｓ）表示。组间均数比较用t检验。多组均数比较用Least-significantdifference(LSD)检验。当p0.05时认为差异有统计学意义。2、结果2．1松果体中AANATmRNA的表达HIBD后6小时、12小时、24小时AANATmRNA的表达水平均低于对应假手术组，而HIBD后0小时、48小时结果与对应假手术组相比无统计学差异；多组均数比较显示，假手术组各时点之间AANATmRNA的表达水平无明显变化，HIBD后6小时开始下降，12小时达低谷，24小时有所回升，48小时恢复（见图1，2）。图1AANATmRNA电泳图＊△＊＊△＊△5*表示与对应假手术组对比P＜0.05;**表示与对应假手术组对比P＜0.01。△表示HIBD组AANATmRNA表达与前一时点相比P＜0.05。2.2血浆MLT水平HIBD后12小时、24小时血浆MLT水平均低于对应假手术组，而HIBD后0小时、6小时、48小时结果与对应假手术组相比无统计学差异；多组均数比较显示，假手术组各时点之间MLT浓度水平无明显变化，HIBD后12小时下降，24小时与12小时MLT水平基本相等，48小时恢复（见表1）。表1新生大鼠各组血浆MLT浓度水平（pg/ml）组别0小时6小时12小时24小时48小时HIBD组90.65±15.6187.37±14.7459.22±9.02**△48.91±8.46**92.17±15.88△假手术组99.18±23.3183.12±11.9488.76±8.2781.20±10.390.68±13.92均n=6**表示与对应假手术组对比P＜0.01。△表示HIBD组AANATmRNA表达与前一时点相比P＜0.05。3、讨论松果体是人类以及哺乳动物的一个重要的神经内分泌中转站，合成MLT需经过一系列酶促反应。其中，AANAT为限速酶，在松果体中有表达。在哺乳动物和人类，MLT的合成路径主要是下丘脑视交叉上核（SCN）接受神经信息发放刺激信号通过交感神经元释放去甲肾上腺素，后者与松果体细胞的肾上腺素能受体结合，激活腺苷酸环化酶(AC)，提高胞内cAMP水平，促进AANAT的基因转录、翻译，从而增加MLT的合成。图2新生大鼠松果体中AANATmRNA的表达63.1HIBD对松果体中AANATmRNA表达的影响本实验结果表明,各假手术组之间AANATmRNA的表达水平无变化，未曾显示昼夜不同，不考虑手术影响因素与文献报道新生大鼠8天后出现AANATmRNA昼夜节律相符合。HIBD后AANATmRNA表达6小时开始下降，12小时达低谷，24小时有所回升，48小时恢复，结合文献探讨其可能机制与下丘脑SCN生物钟控制的扳机作用，自由基的释放，细胞凋亡的增加[7]，兴奋性氨基酸毒性，下丘脑-垂体-