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缺素培养对小麦幼苗生长的影响姓名：侯菲学号：2011070100981实验目的从形态学和生理生化变化方面了解缺素培养对小麦幼苗生长的影响。2实验安排（1）用氯化三苯基四氮唑（TTC）法与红墨水法进行种子生活力的快速测定[实验原理]TTC（2，3，5－三苯基氯化四氮唑）的氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯甲月替（TTF）。应用TTC的水溶液浸泡种子，使之渗入种胚的细胞内，如果种胚具有生命力，其中的脱氢酶就可以将TTC作为受氢体使之还原成为TTF而呈红色，如果种胚死亡便不能染色，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色，因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生命力。有生命力种子胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失生命力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可自由进入细胞内使胚部染色。所以可根据种子胚部是否被染色来判断种子的生命力。此处用红墨水为染料，如果胚不是红色，则说明根具有活力，如果胚被染成红色，则说明根已不具活力。[实验材料]小麦种子[方法与步骤]1.浸种将小麦种子用30℃温水浸种6-8小时，使其充分吸涨，以增加种胚的呼吸速率。2.显色随机取吸涨种子100粒，用单面刀片沿种胚中心线纵切两半，将其中一半置于培养皿中，加入适量的0.5%TTC溶液（以覆盖种子为度），在室温（25℃）下放置30min左右。将另外1半也放入培养皿中，加入5%的红墨水（以覆盖种子为度），染色5-10min。染色时间到后，倒去TTC溶液和红墨水，自来水冲洗1-2次直至洗液无色为止。3.观察凡被TTC染红的种胚为有活力的，反之为死种子。而被红墨水染红过的为死种子，不染色的为有活力的种子。4.记录及计算统计有活力的种子数，求出活力百分数。[注意事项]1选择的种子要浸泡充分，使其膨胀，有利于实验现象的产生。2在挑选种子时，要随机选择，数够100粒。3切种子时，在胚芽处均等切取，防止一半的胚过小，影响实验观察，而且防止胚过小而掉落。4进行实验处理时，要使得100粒种子的一半进行TTC染色，一半进行红墨水染色，保证实验数据准确性。5计数前要把染液洗掉，尽量让一个人记数，使得数据标准一致。（2）植物的溶液培养[实验原理]溶液培养法所利用的矿质元素的种类和数量，可以认为地控制，因此要了解某种元素是否为植物所需要时，可有意识地配制缺乏某种元素的培养液，看植物生长发育过程中是否显示一定的病症，若是植物必需的矿质元素，则培养液中缺乏会引起植物特有的病症，并使生长发育停止，最后引起死亡，并且在生长过程中也会出现一些生理生化变化。[实验材料]小麦幼苗[方法与步骤]1.种子的萌发2.培养器的准备3.培养液的准备（1）贮备液的准备Ca(NO3)2：82.07g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；KNO3：50.56g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；MgSO4·7H2O：61.62g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；KH2PO4：27.22g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；NaNO3：42.45g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；MgCl2：23.81g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；Na2SO4：35.51g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；CaCl2：55.50g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；KCl2：37.28g用蒸馏水溶解并定容为1000mL；微量元素混合液：称取H3BO32.86g、MnCl21.81g、ZnCl20.11g、CuCl2·7H2O0.05g、NaMoO4·2H2O0.025g用蒸馏水溶解并定容为1000mL微量元素中的铁盐单独配置。配法是将2.78gFeSO4·7H2O水溶液缓慢加入到3.73gNa2－EDTA微沸水溶液中，并不断搅拌，最后冷却定容到500mL。（2）培养液的配制按表1用量配制完全培养液和各种缺素培养液表1完全培养液和各种缺素培养液的配制贮备液配制培养液所需/mL/L蒸馏水完全液-N-P-K-Ca-Mg-S-Fe-微量Ca(NO3)210101010101010KNO310101010101010MgSO4·7H2O10101010101010KH2PO410101010101010NaNO3101010MgCl210Na2SO10CaCl210KCl2102.5Fe-EDTA1111111微量元素11111111蒸馏水1000958958965.5968958958958959950配制溶液中，先去蒸馏水900mL，加入贮备液，最后配成1000mL，以避免产生沉淀。培养液配好后，用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调pH值为5-6。4.幼苗的培养5.培养和观察6.生理生化指标的测定[注意事项]1.选用的幼苗生长一致、大小均一。2.培养液所用的药品需保证纯正。3.要每天都定时来摇晃培养液，使其空气流通，不易缺氧，影响呼吸作用。4按时间进行换水，纱布上也要加适量的水。5对比注意观察小麦的生长形态。（3）缺素培养对小麦幼苗根系活力的影响[实验原理]氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。[实验材料]缺素培养的小麦幼苗根系。[方法与步骤]（1）TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。图表标题y=199.97x+53.107010020030040050000.511.52OD值PTF浓度（2）根系活力的测定称根尖0.5g，放入50mL烧杯中，加入0.4%TTC和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，浸没根，37℃下暗保温3h，后加1mol·L-1硫酸2ml，停止反应。（同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样，其他操作同上）。取出根，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，在波长485nm下比色，以乙酸乙酯为空白调零。[结果计算]四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)][注意事项]1药品均用分析纯级药品，实验器具必须非常干净，各贮备液的移液器要专用，实验药品的配制要用无离子水，以确保缺素培养的准确性。2移植植物是要小心，切勿伤根。3乙酸乙酯的味道较刺鼻，实验过程中尽量要使门窗敞开，保持通风。4实验数据要测两三次，求平均值。（4）缺素培养对小麦幼苗叶片内硝酸还原酶活力的影响[实验原理]硝酸还原酶(nitratereductase，NR)，是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：++++NADHNO3-H+NRNO2-NAD+H2O产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(对-氨基苯磺酸胺)及α-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以Nμg/(g.h)为单位。[实验材料]缺素培养的小麦幼苗。[实验步骤]（一）标准曲线的绘制取7支洁净烘干的15mL刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(μg)为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)建立回归方程。试剂/mL管号1234567亚硝酸钠标准溶液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺溶液4444444每管含亚硝态氮/μg00.20.40.81.21.62.0亚硝酸根标准曲线y=7.7291x+0.0093012345600.20.40.60.8OD值浓度（ug/mL）浓度线性(浓度)(二)样品中硝酸还原酶活力测定(1)酶的提取称取材料0.4g鲜样，分别放置于含有下列溶液的烧杯中：对照：0.2mol/L磷酸缓冲液（Ph7.5）5mL+蒸馏水5mL处理：0.2mol/L磷酸缓冲液（Ph7.5）5mL+0.2mol/LKNO35mL(2)抽气(3)酶促反应30℃温箱中暗保温30min。（4）[NO2-]的测定吸取对照液、处理液和蒸馏水各2mL于3支试管中，分别加入磺胺试剂4mL，a-萘胺试剂4mL，混合摇匀，30℃温箱中保温30min，用分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据测得的吸光度值从标准曲线上查得[NO2-]。（5）计算结果NR活力（μgNO2-·g-1FWh-1）=[处理液浓度（μg/mL）-对照液浓度（μg/mL）]*10mL/(叶片鲜重g*时间h)[注意事项]1实验抽气时，要使叶片沉到抽气管底部和中部，保证叶片内的气体全部排出。2抽气中尽量避免叶片的掉落，在抽气管里进行定容。3酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸还原酶把NO2还原成NH3。4实验材料要是进行了一定的光合作用后进行测定。（5）缺素培养对小麦幼苗叶绿素含量的影响[实验原理]根据叶绿体色素对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可利用公式计算出提取液中各色素的含量。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在一定波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光值的总和，这就是吸光值的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中的叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光值A，并根据叶绿素a、b和类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所以用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为645nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，据此列出下列公式：Ca(mg/L)=13.95A663–6.88A645Cb(mg/L)=24.96A645–7.32A663Cx.c(mg/L)=(1000A470–2.05Ca-114.8Cb)/245(类胡萝卜素)[实验材料]缺素培养的小麦幼苗。[实验步骤]将0.1克叶片剪碎，入25mL容量瓶，加95%乙醇25ml，加盖，于30~40℃黑暗的温箱保温24h，至叶片变白，于663、645nm下比色（需注意比色前需添加95%乙醇至容量瓶刻度线）。用95%乙醇作为空白管调零，通过OD值计算叶绿素含量。色素含量（mg·g-1）=浓度（mg·L-1）×提取液总量（ml）/叶片重量（g）×1000[注意事项]1叶绿素一定要洗干净，避免产生实验误差。2叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度过高，可进行适当稀释。3注意分光光度计的正确使用。4所测得的OD值是叶绿素a和叶绿素b混合一起的值，要根据计算公式可分别算出结果。（6）缺素培养对小麦幼苗叶片内可溶性蛋白含量的影响[实验原理]考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（1-1000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度玉蛋白质含量成正比，故可用于