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1基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP-201X-CCRI通信作者：张西岭利用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度在企业中的应用黄殿成1王飞2刘建功1,2刘金海1周关印1,2李根源1张西岭1(1中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455001；2中棉种业科技股份有限公司，郑州450001)中文摘要：本文阐述利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理，剖析中棉种业科技股份有限公司利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的实践过程，指出利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度在企业中发挥的作用。品种真实性和种子纯度是种子质量最重要的指标。传统的通过田间小区种植利用形态特征鉴定种子纯度的方法，具有周期长、易受环境和人为因素影响、属于事后控制等缺陷，与种子企业需要快速检验结果的要求不相适应，难以有效消除种子企业的质量风险。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的技术逐步成熟，中棉种业科技股份有限公司（以下简称中棉种业）在利用分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度的反复实践中，逐步形成了自己的检验规程，在企业经营中发挥了较好作用。1利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、串联排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成(如编码rRNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列不完全相同，可表现出多个位点的多态性。基于这一想法，人们发2基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP-201X-CCRI通信作者：张西岭展起了SSR标记，该标记也是目前种子分子鉴定中最常用的标记。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比限制性片段长度多态性（RFLP）标记高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组；(2)具有多等位基因的特性，多态性丰富；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。目前，该技术已广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标记、指纹图谱的绘制等研究中。近年来，SSR标记在种子检验中应用速度发展很快。2利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度在企业中的实践过程2.1引进人才利用SSR分子标记技术对棉花进行品种真实性和纯度鉴定的方法，具有专业性强、操作复杂等特点，对人员的素质提出了更高要求。因此，高素质人才是企业能否开展应用该技术的决定因素。为此，中棉公司于2010年先后从华中农业大学、中国农科院等处招聘多名硕士研究生，同时，对一般的操作人员先后送至南京农业大学以及中棉所课题组进行短期理论培训、技能实践。人才的引进和培训，对于中棉种业顺利应用SSR分子标记开展鉴定工作奠定了坚实基础。2.2购置设备“俏媳妇难为无米之炊”。开展鉴定工作离不开基本的仪器设备，为此，中棉公司先后利用项目资金、自有资金，购入8台PCR仪器，16套电泳仪，5套移液器，5套离心机等必备设备，建立了标准化的分子生物学实验室。2.3筛选引物及检测实例检验人员借助于国内主要的棉花品种，对400对引物逐一筛选，最终筛选出3基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP-201X-CCRI通信作者：张西岭多态性好、带型清晰、易于辨别的20对核心引物。分别提取若干个棉花杂交种F1待测样品及其亲本的DNA，利用前期筛选到的20对核心引物进行电泳检测，最后根据电泳结果选取与亲本带型互补，带型清晰稳定的5对引物作为该品种纯度检测引物，如图2.1所示，Q76和M68为某杂交种引物筛选电泳图，1-9为父本，10-18为母本，19-24为待测样品，通过观察可发现待测样品分别在这两个引物位点上表现出双亲互补带型，且带型清晰稳定，因此确定其为该品种纯度鉴定所用引物。运用筛选得到的引物对相应品种做检测验证时，待测样品的样本数为96粒，检测结果表明，通过与田间小区种植鉴定结果相比较，可发现通过田间小区种植鉴定的检验结果虽然一般高于利用分子标记鉴定的检验结果，但二者成显著的正相关关系。因此利用分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的方法基本可行。图13利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度在企业中的应用效果3.1省时高效传统的通过田间小区种植利用形态鉴定棉花品种真实性和种子纯度的方法，往往需要在第二年8-9月份才能获得鉴定结果，即使种子生产出来的当年到海南岛进行加代鉴定，也需要在来年的3-4月份获得鉴定结果。鉴定结果出来时，被鉴定的种子批往往是已经销售一空，更多情况下则是已经种植到田间。因此，传统鉴定方法属于事后控制，难以真正发挥监管作用。利用SSR分子标记技术鉴定品种真实性和种子纯度时，如果提取棉花叶片的DNA，即使加上种子发芽成苗需要5-7天左右的时间，9天左右也可获得纯度鉴定结果。后来采用改进的DNA提取技术，直接用种子提取DNA，鉴定速度大大加快，24小时就可以获得鉴定结4基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP-201X-CCRI通信作者：张西岭果。3.2减少成本传统的通过田间小区种植鉴定品种真实性和种子纯度的方法，666.7平方米可鉴定50个样品，一个样品平均费用需要55元左右；利用SSR分子标记技术鉴定，成本60元左右，与传统鉴定方法的费用基本相当，能够被种子企业所接受。为防止种子质量不达标，在棉花种子生产季节，中棉公司每年派出30多人，进驻生产基地，吃住在村里，进行全程监督管理，后期采用地头收购籽棉等办法的时候，在前期基础上，后期需要进一步增加监督管理人员，这使得生产管理成本高达2元/千克种子。中棉公司采用利用分子标记技术鉴定种子纯度后，通过会议，广泛宣传“分子标记技术鉴定种子纯度就像孙悟空火眼金睛一样，准确快速”，种子送至公司后，经检查合格后公司收购，不合格退还给制种农户，把责任和质量压力传导给群众，此举使得农户的责任心大大增强，掺杂使假现象明显减少，不仅种子质量大大提高，而且进驻基地的管理人员由原来的30多人减少至5人，仅此一项，每年可以减少生产成本50万元-80万元之多。3.3化解纠纷生产基地上交种子的时间一般为每年的10月底-11月底，在未应用SSR分子标记技术鉴定前，为保证市场需求，中棉公司对基地送来的种子只能在对发芽率指标初步检测后就进行加工，而无法在加工前对品种真实性和种子纯度进行检测。在来年田间小区种植鉴定结束后，如果发现纯度达不到合同约定标准，在与生产基地进行协商扣款时，基地推诿说是“中棉公司在加工环节、种植环节导致混杂”，供需双方往往出现纠纷；如果对双方封存的样品进行再次鉴定，又需要长达一年的一个生产周期。采用SSR分子标记技术后，可以在种子加工前及时鉴定种子纯度，如果基地认为鉴定的不准确，可以申请进行二次复检，对复检达不到约定标准的种子，公司直接予以拒收或者协商价格，此举可减少、化解与生产基地发生纠纷的尴尬现象。3.4降低风险传统的通过田间小区种植鉴定品种真实性和种子纯度的办法，在鉴定结果出5基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP-201X-CCRI通信作者：张西岭来前，被鉴定的种子批已经销售出去甚至已经种植到田间，该方法对于控制纯度风险而言，属于事后控制。利用SSR分子标记进行鉴定，可以很快获得鉴定结果，对于达到约定标准的种子可以放心加工销售，对于低于约定标准的种子可以暂缓加工销售，以待来年进一步进行田间小区种植鉴定，这样，不合格的种子流入市场的可能性大为减少，降低了种子企业承担的质量风险。