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-1-从MHCⅠ/Ⅱ类相关因子探讨针灸对带状疱疹的免疫逃避作用学号：12007076姓名：李建伟专业：中医外科学(一)研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题1.研究内容课题以VZV免疫逃避机制中发挥着重要作用的感染病毒细胞免疫识别的MHCⅠ/Ⅱ类基因抑制为切入点，围绕IFN-γ和参与免疫逃避的的两条主要途径，有目的地观察IFN-γ和相关基因CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律，进一步检测CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA、MHCⅡmRNA的表达变化以及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性的动态变化，并对上述指标的相关性及变化规律进行分析，说明调节VZV病毒感染的免疫逃避机制是针灸治疗带状疱疹、减轻疼痛和后遗症的关键。且明确针刺与放血作用机制的差异所在。主要开展以下工作：研究内容：（1）皮损组织病理学观察。（2）镜检：外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。（3）流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。（4）免疫组化法ABC染色法检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。（5）westernblot检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。（6）RT-PCR法检测：皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA、MHCⅡmRNA。2.研究目标：2.2.1旨在明确针灸治疗带状疱疹，减轻疼痛和后遗神经痛，与调节MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的分布及表达关系，为针灸治疗免疫逃避类疾病提供科学依据。2.2.2通过比较针灸与传统抗病毒药物的作用差异，为解决带状疱疹病毒耐药性问题提供理论依据。2.2.3旨在明确针刺与放血在治疗疱疹作用机制中的差异。-2-3.拟解决的关键性问题：针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的调节与其有效干预VZV病毒免疫逃避机制的关系。(二)拟采用的方案及可行性分析1.拟采用的方案实验环境：实验室相对封闭，自然采光，环境温度控制在20℃～25℃之间，湿度控制在60%左右。实验动物：清洁级昆明种小鼠，体重22～24g，笼养，自由饮食，由上海市实验动物中心提供全价动物颗粒饲料。1.1分组及造模：第一次实验采用大鼠192只，按照体重分层随机，分为6组，每组8只，在造模完成后开始治疗，连续7天，隔日（第1、3、5、7天）处死一批，动态观察针刺放血对大鼠VZV病毒初感染的影响；第二次实验在造模后30天开始治疗，观察针刺放血对大鼠VZV病毒潜伏、复发的影响，其他处理同上，第7天处死取材观察；造模：腹腔注射VZV8805株系病毒，按照100TCID50/0.1ml病毒量接种细胞，感染后48小时，模型即成。模型组：造模方法同上，每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定，连续7天。药物组：造模方法同上。左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d，连续三天，每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定，连续7天。针刺组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，在造模完成后，开始针刺，进针0.2～0.3mm，平补平泻，留针10min，每日1次，连续7天。放血组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，使用皮肤针沿皮损和脊神经叩刺，连续7天。针刺加放血组：方法同针刺组和放血组，治疗连续7天。正常组：腹腔注射同体积生理盐水。每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定，连续7天。1.2取材方法：-3-造模结束后，在模型组40只中随机处死8只，取材检测VZV对对小鼠相关指标的影响。针刺组、放血组、针刺加放血组、药物组、正常组在治疗后的第1、3、5、7天随机处死8只小鼠取材。取材放入-80oC低温冰箱保存、备检。1.3穴位选取：固定小鼠方法：根据小鼠的形体，在木板上钉上四个适当距离的铁钉，将夹子套在铁钉上，用夹子夹住小鼠的四肢以做固定。小鼠穴位定位参考《实验针灸学》，模拟小鼠的定位方法：“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间；“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间，左右侧各一穴；“合谷”在在手背，当第二掌骨桡侧的中点处，“曲池”在在肘横纹外侧端，当尺泽与肱骨外上髁连线中点，“委中”在在腘横纹中点，当股二头肌腱与半腱肌腱的中间，“尺泽”在在肘横纹中，肱二头肌腱桡侧凹陷处。1.4观察指标及方法：1.4.1皮肤组织病理切片1.4.2镜检：外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数各组小鼠每天定时，专人割尾静脉采血10μl，加入0.38ml的白细胞稀释液中，摇匀，静置3分钟，光镜查外周血有核细胞、白细胞数和淋巴细胞、巨噬细胞分类计数；1.4.3流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。①制备样品：处死动物，离心，收集细胞悬液，滴加特异性免疫荧光抗体，用流式细胞仪上机检测并进行分选。②流式细胞仪检测：将分选细胞清洗、离心(1500RPM，10min)，清洗两次，弃上清；加入PI荧光标记抗体；用流氏细胞仪分别检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。③分析方法：测出的数据经PHOENIX公司分析软件Multicycle处理，得出细胞各周期的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞相对含量和百分数,并绘出DNA分布的直方图。1.4.4免疫组化法ABC染色法检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。①制备样品：处死动物，取股骨骨髓，10%福尔马林固定标本，石蜡-4-包埋，4μm厚切片。②免疫组化染色检测方法：鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(DO-27)（武汉博士德生物有限责任公司，浓度1:50）；鼠抗人cyclinD1单克隆抗体（DCS/6）（NeoMarker福州迈新公司，浓度1:100）；鼠抗人单克隆抗体CⅡTa、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ（晶美公司）；S-P免疫组化试剂盒（北京中山公司）。ABC法：用0.1mol/LPBST洗，切片与0.1mol/LPBST(含0.5%H2O2)作用30min，用0.1mol/LPBST洗,10min×3次，与一抗4℃温育，用0.1mol/LPBST洗,10min×3次，与二抗(1:1000稀释)室温作用2h，用0.1mol/LPBST洗，10min×3次，与ABC(1:2000稀释)室温作用1h.用0.1mol/LPBST洗，10min×3次.在DAB溶液中反应，用0.05mol/LTris-HCl缓冲液终止反应，用包被有明胶的玻片固定、水洗，用系列浓度乙醇(70%1次，80%1次，90%2次，95%2次，100%3次，每次5min)脱水，二甲苯中透明，封边。③分析方法：IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ免疫组化阳性信号均为棕黄色细颗粒状，染色结果按阳性细胞百分比及染色强度综合记分作半定量分析。1.4.5westernblot检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。①制备样品：取样品1×106～1×107细胞，PBS清洗，去PBS加0.1～1ml总蛋白抽提试剂抽提总蛋白；使用KCTMBCA蛋白质定量试剂盒，测定样品浓度。②方法：变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)；蛋白质转移到硝酸纤维膜，30mA恒流，4°C转移，过夜；膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时，加入一级抗体室温孵育1.5小时；加入HRP标记的二级抗体，室温孵育1小时；化学发光法检测，X胶片曝光显影。③分析方法：扫描图片，用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化；将目的蛋白灰度值除以内参GAPDF的灰度值，校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。1.4.6RT-PCR法检测：皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA、MHCⅡmRNA。①提取总RNA：取标本，用试剂(GIB-CO公司，美国)提取总RNA，溶于-5-无RNA酶的灭菌超纯水中，用紫外分光分度计测定总RNA的浓度和纯度，同时琼脂糖电泳观察其完整性。将RNA稀释成1mg/L，-80°C保存。②MHCⅠ、MHCⅡ和β-actin引物序列CⅡTa:5′-ACTCGATATCATTCCGGCAGACCTGAAGCAT-3′5′-GCTCACTGCC-CCAGCCCAATA-3′MHCⅠ:5’-TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3’5’-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA-3’MHCⅡ:5’-ACCAACGGGACGAGCGCAT-3’5’-CAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3’β-actin:5’-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3’5’-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3’PCR反应体系30μl，转录产物3μl，2UTaqDNA聚合酶，10mmol/L4×dNTP2μlPOLβ和β-actin引物。反应条件：94°C预变性；94°C50s，55°C55s，72°C60s，72°C10min共30个循环。③分析方法：产物经SYNGENE凝胶成像系统分析，以目的基因和β-actin积分灰度值的比值，作为目的基因mRNA的相对表达量。研究路线-6-昆明种小鼠CTX100mg/kg/d，连续3天正常组模型组针刺组放血组以上各组在造模后后每天相同时间，分别进行相应处理，并作动态观察。正常组给予同体积的生理盐水；针刺组10min/次/天，放血组皮肤针沿皮损和脊神经叩刺，1次/天，药物组、正常组、模型组陪同固定。外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。皮损组织病理学观察药物组流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。免疫组化法检测皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白表达及分布规律Westernblot检测皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白表达量RT-PCR方法测定:CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA、MHCⅡmRNA表达率和表达量针刺放血组Spss统计分析得出结论、撰写论文左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d-7-3.可行性分析：1、本人针灸专业硕士、中医外科皮肤病方向在读博士，多学科背景保证实验研究按计划进展并不断推向深入。2、前期大量的临床实践和文献回顾性研究显示出针刺放血可改善VZV感染机体免疫功能；3、研究思路清晰，目的明确，有成熟的理论指导，所选指标针对性强，研究方案可行，研究方法及技术路线成熟；4、实验室的软件、硬件设备完全具备科研条件。上海中医药大学实验室条件先进，课题所需仪器设备均已具有，所需试剂、抗体均可购买。5、课题组成员层次结构、知识结构合理，有较强的科研能力和团结协作精神。4.本项目的特色与创新之处1、首次开展针灸对VZV免疫逃避机制的研究，进一步揭示针灸改善调节VZV感染机体免疫功能的的分子生物学机制，也为针灸治疗病毒感染的相关疾病提供了理论依据。2、通过研究针灸对带状疱疹后遗神经痛的调节机制，促进临床药物、针刺放血等多种疗法相结合，提高临床疗效，更具实际意义。3、首次探讨针刺与放血疗法在改善VZV感染机体免疫功能中的差异，为两种疗法治疗不同病理的相关疾病提供实验依据。5.年度研究计划及预期研究结果2008.01-2008.06建立动物模型，进行细胞分选及各项检测的预实验。2008.07-2009.07扩大样本数量，应用流式细胞仪、免疫组织化学方法、WesternBlot法、RT-PCR法等方法，完成所有实验。2010.08-2010.12完成统计学处理，进行课题总结。6.预期研究结果本课题通过观察针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关酶类和蛋白的影响，从而揭示针灸对抗病毒、提高免疫力作用新的分子生物学机制，为针灸在皮肤病及相关免疫类疾病中的应用提供可靠的实验室依据，丰富针灸的科学内涵。其研究成果不仅为免疫逃避类相关疾病