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D-葡萄糖醛酸包裹的超微稀土氧化物（稀土=铕、钆、镝、钬和铒）纳米粒子磁共振成像造影剂摘要：提供一种易于一步合成的D-葡萄糖醛酸包裹的超微稀土氧化物（稀土＝铕、钆、镝、钬、铒）纳米粒子，研究它们水质子弛豫效能来证明他们作为一种新的潜在的磁共振成像造影剂的可能性。我们将重点放在D-葡萄糖醛酸包裹的超微氧化镝纳米粒子上，因为它在研究的纳米粒子之间表现出非常高的弛豫效率。其表现为T2弛豫时间，磁共振造影剂通过它的3T，T2弛豫时间磁共振成像在老鼠体内被证明，表明它可以在高的磁共振领域合理的设计一个新的T2弛豫时间的磁共振成像造影剂中被利用。关键词：稀土氧化物、超微纳米粒子、磁共振成像造影剂、一步合成1、引言到目前为止，表面包覆磁性纳米粒子因为其在各种生物和医学领域的潜在应用前景而被仔细研究，这些包括生物分子的固定和生物分离，如蛋白质、多肽、酶、药物和基因传递等的磁共振成像和热疗。这其中，纳米粒子作为磁共振成像造影剂的应用被积极推行，因为他们比分子螯合物表现出更高的水质子弛豫效能。到现在为止，氧化铁纳米粒子，铁素体纳米粒子，氧化锰纳米粒子，氧化钆纳米离子，钆的化合物纳米粒子，氧化镝纳米粒子已被研究。有趣的是，有些材料如铁钴纳米粒子以及最常用的氧化铁纳米粒子表现出很强的T1（或正）和T2（或负）的对比。这是因为它们都有高的纵向（r1）和横向（r2）水质子弛豫效能。在上述纳米粒子中，只有葡聚糖覆盖的氧化铁纳米粒子作为T2磁共振成像造影剂是能够在市场买到的商品。然而，大颗粒氧化铁纳米粒子的直径往往限制了其在临床中的应用，因为它们大多在肝脏积累。因此，要开发具有高的水质子弛豫效能的超小型纳米粒子来克服这一缺点。镧系元素氧化物（稀土氧化物，下同）纳米粒子是T1和T2弛豫时间磁共振成像造影剂很有前途的候选物质。两个原因包括，它们是顺磁性的，一些稀土金属元素的磁矩都很高。虽然超顺磁纳米粒子比如氧化铁纳米粒子，在大小区域表现出较差的r2弛豫效率，在肾清除中是预期有效的。超微稀土氧化物纳米粒子的r2弛豫效率是显著的。大部分对氧化钆纳米离子的研究表明它在超小颗粒直径时有高的r1弛豫效率。它们作为T1弛豫时间磁共振成像造影剂的性能已经在体内被证明。然而，它们的毒性很大，因此，应该用生物相容的配位体很好的包裹。而且，它们应该在注射后几个小时内通过膀胱全部排出体外。接下来关于直径有点大的氧化镝纳米粒子的大多数的研究表明它有高的r2弛豫效率。然而，它们超微直径粒子的水质子弛豫效能，在体外的细胞毒作用和在体内作为T2磁共振成像造影剂的性能还没有被研究。在这项工作中，我们第一次研究它们超微直径粒子的水质子弛豫效能，在体外的细胞毒作用和在体内作为T2磁共振成像造影剂的性能。虽然到目前为止已经报道了各种方法来产生3d过渡金属氧化物纳米粒子，但其中一些可能无法应用于镧系元素。例如，由于稀土金属碱转化为稀土金属氧化物需要高的脱水活化能，当镧系金属盐在水溶液中与氢氧根离子在环境温度下反应时，产生的是稀土金属的碱纳米粒子和纳米棒而不是稀土氧化物纳米粒子。这和3d过渡金属盐因为他们的氢氧化物的低的脱水活化能而很容易形成氧化物正相反。因此，应当设计适当的稀土金属纳米粒子合成方法。在这项工作中，我们开发了一种合成稀土金属氧化物（稀土=铕、钆、镝、钬和铒）纳米粒子的简便方法。再将它们包裹上在体外和体内核磁实验都不分离的生物相容的和水溶性的D-葡萄糖醛酸。需要注意的是，有些大型镧系金属纳米晶体在有机溶剂中合成。然而，目前工作中的合成方法与上述的方法不一样，最终产物的形态和大小也不一样。上述方法提供直径9-20纳米的纳米片和纳米盘，而我们的工作提供接近球形的超微纳米粒子。在这项工作中，介绍了一种简单的一步合成D-葡萄糖醛酸包裹超微稀土金属氧化物纳米粒子的方法。研究它们的水质子弛豫效能来证明其作为磁共振成像造影剂的可能性。一些D-葡萄糖酸包裹的纳米粒子在水中的胶体悬浮液表现出高的水质子弛豫效能和显著地剂量依赖性，与它们图像中的提高形成对比。然后我们关注D-葡萄糖醛酸包裹的超微氧化镝纳米粒子由于它的高的r2弛豫效能。它在体外细胞毒性试验中被认为是无毒的。其实用性作为T2磁共振成像造影剂第一次通过3TT2弛豫时间磁共振成像在老鼠体内被证明。图1.D-葡萄糖醛酸包裹的超小型稀土金属氧化物纳米粒子高压电子显微镜图像(稀土金属=(a)铕,(b)钆,(c)镝,(d)钬,和(e)铒)表1，D-葡萄糖醛酸覆盖的超微稀土金属氧化物纳米粒子的平均粒径和r1、r2弛豫时间。2、实验步骤：药品：所有的化学药品如GdCl3.xH2O(99.9%),Dy(NO3)3.5H2O(99.99%),Er(NO3)3.5H2O(99.99%),Eu(NO3)3.5H2O(99.9%),Ho(NO)3.5H2O(99.99%),NaOH(99.9%),50%双氧水，三甘醇(99%),D-葡萄糖醛酸(99.99%)均购自Sigma-Aldrich公司，直接使用。用三次蒸馏水洗涤样品和制备磁共振成像的样品溶液。合成超微稀土金属氧化物纳米粒子：为了合成超微稀土金属氧化物纳米粒子，我们在圆底烧瓶的30毫升的三甘醇中加入5毫摩尔的稀有金属前体，将反应置于50摄氏度磁力搅拌的条件下，直到前体完全溶解于三甘醇中，该溶液变得透明（溶液的颜色，铕、钆、镝没有颜色，钬和铒粉红色），然后向反应混合物中加入15毫摩尔的氢氧化钠颗粒，接着升高反应温度并保持在八十度，反应继续发生，知道两个多小时后氢氧化钠完全溶解。刚刚加入氢氧化钠一段时间内溶液将变得浑浊，然后又变得透明（溶液的颜色，铕、钆、镝是黄色，钬和铒是暗红色），然后将7.5毫升过氧化氢水溶液通过注射器缓慢滴入反应混合物中。在加入双氧水并且溶液又变浑浊并伴随着颜色变化的过程中，有大量氧气产生（通过火焰实验证实），由于超微稀土金属氧化物纳米粒子的形成（溶液颜色，铕、钆、镝是白色。钬和铒是粉白色）。反应物停止反应后两个小时。注意在高温条件下没有过氧化氢的加入也可以形成超微稀土金属氧化物纳米粒子。然而，我们发现，超微稀土金属氧化物纳米粒子在加入双氧水之后可一个更有效的形成，即使在这里采用的温度较低的条件下。表面覆盖D-葡萄糖醛酸的超微稀土金属氧化物纳米粒子：要合成表面覆盖D-葡萄糖醛酸的超微稀土金属氧化物纳米粒子，需要向上述溶液中加入5毫摩尔的D-葡萄糖醛酸。这个表面覆盖反应要持续另外六个小时。反应完成后，将溶液冷却到室温。将溶液转移到含有500毫升三重蒸馏水的1升的烧杯中，然后用磁力搅拌一个小时。将其放置一个星期，或者知道D-葡萄糖醛酸覆盖在超微稀土金属纳米粒子上。顶部的透明溶液一如到其他容器，剩下的样品溶液再次用三重蒸馏水洗涤。该过程重复三次。样品溶液一班的体积用来准备核磁共振成像的三重蒸馏水溶液（溶液颜色，钆和镝，是淡黄色，铕是黄色，钬和铒是深黄色）。核磁共振成像溶液的典型浓度是30毫摩尔稀土金属。剩下一半体积的样品在空气中干燥成粉末，用于各种形式的表征如下文所述。表征：高压电子显微镜（日本电子光学实验室，1300秒，1.2兆伏加速电压）被用来测量D-葡萄糖醛酸覆盖的超微稀土金属氧化物纳米粒子的粒径。覆盖无定形碳的铜网（派尔高公司，160号）放在滤纸上，用微量吸管（艾本德公司，2-20微升）将三重蒸馏水稀释过的样品溶液滴在铜网上面。用X-射线衍射光谱仪（飞利浦公司）和一个未经过滤的铜靶辐射来测量覆盖D-葡萄糖醛酸的超微稀土金属氧化物纳米粒子的晶体结构。扫描步骤和扫描范围分别为2θ是0.033度和15-100度。通过使用电感耦合等离子体测定在核磁共振成像中稀土金属的浓度。为了确定这一点，提取1毫升的核磁共振成像溶液用酸预处理使纳米粒子完全溶解。傅里叶变换红外吸收光谱仪（马特森仪器公司）用于验证表面涂层。为了记录傅里叶变换红外吸收光谱（400-4000cm-1），需要植被一个在溴化钾中的粉末的样品。热重分析仪用于估计样品表面涂层的含量。当空气流动时，记录从室温到七百摄氏度的每种粉末样品的热重分析曲线。从热重分析曲线中的质量下降来估计D-葡萄糖醛酸表面涂层的最大量。用超导量子干涉器磁力计（量子设计）来测量超微稀土氧化物纳米粒子的磁性。记录磁化对外加磁场的温度曲线（温度5开和300开）和零场冷却曲线（温度3至330开，磁场强度为100奥斯特）。为了测量磁化对外加磁场的温度曲线和零场冷却曲线，每个称重的粉末样品要放入非磁性的明胶胶囊中。对于样品的占主导地位的磁化作用而言，胶囊的非常小的饭磁性可以忽略不计。从热重分析曲线来估计它的质量分数，从而得到每个超微稀土金属氧化物纳米粒子的磁化质量校正。图2.D-葡萄糖醛酸覆盖的超微稀土金属氧化物纳米粒子的XRD模型(标签：制备样品”)然后得到稀土金属纳米粒子热重分析至700摄氏度(标签：热重分析之后)(稀土金属=(a)铕,(b)钆,(c)镝,(d)钬,(e)铒).r1和r2弛豫效率和R1和R2图像的测量：用装备了围线圈的1.5T核磁共振成像仪测量R1和R2的图像，以及T1和T2弛豫时间。用三次蒸馏水稀释每一份磁共振成像溶液，来制备一系列的五个不同浓度的水溶液（1、0.5、0.25、0.125和0.0625毫摩尔的稀土金属），然后用此溶液测量成像和弛豫时间。从T1分之一和T2分之一对稀土金属的浓度图像的斜率来分别来估计r1和r2弛豫效率。测量参数如下：外部核磁共振磁场（H）=1.5T，温度=22摄氏度，获得的数量（NEX）=1，视角（FOV）=16厘米，矩阵大小=512×512，层厚=5毫米，间距=0，像素带宽=61.0547，重复时间=2009毫秒，回声时间=9毫秒。图3，.D-葡萄糖醛酸覆盖的超微稀土金属氧化物纳米粒子的傅里叶变换红外吸收光谱图(稀土金属=(a)铕,(b)钆,(c)镝,(d)钬,(e)铒).体外细胞毒性测试：用培养基血清球蛋白发光细胞免疫活性来检测氧化镝磁共振成像溶液的细胞毒性。在该实验中，细胞内的ATP用光度计定量。细胞系使用人类前列腺癌细胞和正常小鼠的干细胞。细胞介终于24孔细胞培养板中并培养24小时。用无菌磷酸盐缓冲溶液稀磁共振成像样品溶液，来制备四中测试浓度的溶液。每种测试溶液取2微升放到细胞培养介质中进行处理，将处理过的细胞培养基培养48小时。测量每个样品中细胞存活率和其相对于镝浓度为零的细胞系的标准对照。每个测量样品重复测量三次以获得平均细胞存活率。在体内的T2磁共振成像测量：通过使用3T磁共振成像扫描仪得到T2磁共振成像。韩国庆北大学动物研究委员会按照规则对动物体内研究进行了实验，使用一个6.5周的体重116克的雄性老鼠。测量在向老鼠尾静脉内注射磁共振成像溶液之前和之后进行，注射剂量是每千克0.05毫摩尔镝。测量期间，用温水毯是老鼠保持在37摄氏度。测量之后，老鼠从麻醉剂中苏醒，放回笼子里，供给食物和水。测量参数如下所示：H=3T，温度37摄氏度，数量是4，视角6-9厘米，相视角为0.7，矩阵大小256×256，切片厚度1-2毫米，间隔0.5-1毫米，像素带宽31.5，TR=50毫秒，TE=3000毫秒，通过面积为8.63平方毫米的圆形有效区域来分析注射前后T2磁共振成像的信号强度。该归一化信号强度通过注射前后各个时间点的测量来估计。2、结果与讨论颗粒直径和晶体结构：D-葡萄糖醛酸覆盖的超微稀土金属氧化物纳米粒子的高压电子显微镜图像如图1所示。平均粒径范围从2.0-3.0纳米，如表1所提供。通过使用这些高压电子显微镜图像，我们可以测量粒径超过50-76的纳米粒子。通过使用服从对数正态分布函数，我们拟合粒径估，估计平均粒径如表1所提供。所制备的粉末样品的X射线衍射图谱如图2所示。一致的三个阶段中（稀土金属的氢氧化物，过氧化物，和氧化物），得到的每个X射线衍射图谱都很接近稀土金属氧化物的图谱。广泛的X射线衍射图谱表明，大多数超微稀土氧化物纳米粒子都没有完全结晶，因为它们的超微粒径和观察到的超微氧化钆纳米粒子相似。然而，在粉末样品高达700摄氏度的热重分析之后，高峰222，400,440,622对应一个高度结晶的金属氧化物所具