立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能

中国组织工程研究第20卷第10期2016–03–04出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch4,2016Vol.20,No.10P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·刁新峰，男，1981年生，河南省省邓州市人，汉族，2004年郑州大学毕业，主治医师，主要从事神经外科疾病的研究与治疗。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)10-01446-06稿件接受：2016-02-04，程立敏2，薛咏1，胡成旺1，蔡中立3(南阳医学高等专科学校第一附属医院，1神经外科，2神经内科，3胸外科，河南省南阳市473000)引用本文：刁新峰，程立敏，薛咏，胡成旺，蔡中立.立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能[J].中国组织工程研究，2016，20(10):1446-1451.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.011ORCID:0000-0002-2828-950X(刁新峰)文章快速阅读：文题释义：神经干细胞的治疗作用：①细胞替代：补充缺失神经元和胶质细胞，促进神经环路重建。②递质补充：分泌多巴胺递质。③营养支持：分泌多种神经营养因子，改善局部微环境并启动再生相关基因的表达，完成神经修复。④细胞动员：脑室室管膜下区细胞、海马结构部位内源性干细胞增生。⑤结构整合：整合到宿主移植部位，实现真正神经再生。立体定向技术：在立体定向仪的引导下，将特制的射频电极、干细胞针等手术器械准确送到颅内的特定部位或靶点，成为治疗疾病或诊断疾病的一种方式。现代立体定向技术是在传统立体定向技术的基础上，借助于先进的CT、MRI图像融合技术和立体定向图谱匹配系统进行定位治疗的一种崭新的技术，使治疗更安全更有效。摘要背景：细胞替代治疗是重建受损神经系统组织结构，恢复神经系统功能的一种有效策略，具有极为广阔的应用前景。目的：探讨立体定向脑内移植神经干细胞对颅脑损伤大鼠神经运动功能的影响。方法：将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组，每组10只，应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，伤后1d研究组大鼠脑实质内移植胚胎神经干细胞，对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。在脑损伤前1d、伤后1d、1周、2周运用神经学缺损评分法评价大鼠运动神经功能。移植后2周，取脑组织分别行苏木精-伊红染色、抗BrdU、胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶免疫组化染色。结果与结论：伤后1，2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P0.05)。研究组大鼠受损脑组织中有较多的BrdU阳性神经干细胞，一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶阳性表达，对照组大鼠受损脑组织中未见有BrdU阳性细胞。实验结果表明，立体定向脑内移植神经干细胞可以在颅脑损伤灶中增殖分化，进而显著改善大鼠的神经运动功能。关键词：干细胞；移植；神经干细胞；立体定向脑内移植；颅脑损伤；增殖；分化主题词：神经干细胞；颅脑损伤；细胞增殖；细胞分化；组织工程立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能体外培养胚胎神经干细胞立体定向注射到脑实质内颅脑损伤神经运动功能显著改善刁新峰，等.立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1447(1DepartmentofNeurosurgery,2DepartmentofNeurology,3DepartmentofThoracicSurgery,FirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,Nanyang473000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Cellreplacementtherapyasaneffectivestrategyforreconstructionofthecentralnervoussystemhasverybroadapplicationprospects.OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofstereotactictransplantationofneuralstemcellsintothebrainontheneuromotorfunctionofcraniocerebraltraumarats.METHODS:TwentymaleSprague-Dawleyratswereequivalentlyrandomizedintostudyandcontrolgroups.Animalmodelsofcraniocerebraltraumaweremadeusingtheimprovedfree-fallmethodintherats.Then,modelratsinthestudyandcontrolgroupsweregivenparenchymaltransplantationofembryonicneuralstemcellsandthesamevolumeofculturemediumwithnostemcellsat1dayafterinjury,respectively.Neuromotorfunctionofratswasassessedbasedontheneurologicalseverityscores.At2weeksaftertransplantation,braintissuesweretakenforhematoxylin-eosinstaining,anti-BrdU,glialfibrillaryacidicprotein,β-tubulinIIIandtyrosinehydroxylaseimmunohistochemistrystaining.RESULTSANDCONCLUSION:Theneurologicalseverityscoresinthestudygroupweresignificantlylowerthanthoseinthecontrolgroupat1and2weeksafterinjury(P0.05).Inthestudygroup,thereweremanyBrdU-positiveneuralstemcellsinthebraintissues,someofwhichwerepositiveforglialfibrillaryacidicprotein,β-tubulinIIIandtyrosinehydroxylase;whileinthecontrolgroup,therewasnoBrdU-positivecellinthebraintissues.Experimentalfindingsshowthatneuralstemcellsstereotacticallytransplantedintothebraincanproliferateanddifferentiateinthebrainlesion,andtherebynotablyimprovetheneuromotorfunctionofratswithcraniocerebraltrauma.Subjectheadings:NeuralStemCells;CraniocerebralTrauma;CellProliferation;CellDifferentiation;TissueEngineeringCitethisarticle:DiaoXF,ChengLM,XueY,HuCW,CaiZL.Stereotactictransplantationofneuralstemcellsintothebrainimprovesmotorfunctionofcraniocerebraltraumarats.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(10):1446-1451.0引言Introduction当前颅脑损伤已经成为威胁人类健康的重大疾病，由于神经细胞的不可再生性而使疾病对人体的损害不可逆转。传统的治疗方法也往往无法获得理想的效果。随着干细胞技术的不断发展，人们开始通过干细胞移植方式治疗疾病。干细胞具有很强的多向分化能力，可以在一定条件下发生定向分化。1992年，学者Reynolds与Weiss通过研究发现，在成年中枢神经系统的室管膜下以及胚胎中存在一群特殊的细胞，这种细胞具有一定的自我增殖能力和干细胞特性，并提出了“神经干细胞”这一概念。神经干细胞属于一种多能干细胞，来源于中枢神经系统，具有自我更新能力，在特定条件诱导下，能够分化为神经胶质细胞或特定类型神经元，参与修复神经损伤。神经干细胞在胚胎时期的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位，如脑室、脑室下区、中脑导水管周围。侧脑室附近的室管膜下区和海马是哺乳动物神经系统中神经干细胞最为集中的部位，近年的研究发现，位于室管膜前下区的神经干细胞具有特殊的迁移分化特性。首先，室管膜前下区神经干细胞是出生后嗅球中间神经元终身更新的来源，室管膜前下区神经干细胞产生后，沿着一条高度局限的迁移通道——嘴侧迁移流以首尾相连的链式模式朝嗅球迁移，到达嗅球中央后，朝周边的颗粒细胞层和球周细胞层迁移而到达迁移终点，分化形成颗粒细胞和球周细胞，大约30%的球周细胞属于γ-氨基丁酸能神经元，70%的球周细胞属于多巴胺能神经元，它们是中枢神经系统中最大的多巴胺能神经元细胞群之一。近年来，脑实质内干细胞移植疗法已经成为一种新策略[1]。但是，关于神经干细胞移植后在颅脑损伤局部的增殖和分化情况尚不清楚。为此，实验制备重型颅脑损伤大鼠模型，并向脑损伤部位注射神经干细胞，观察移植后大鼠神经功能恢复以及脑组织中神经元数量变化，以了解神经干细胞在损伤灶中的增殖和分化情况。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照动物实验。刁新峰，等.立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能P.O.Box10002,Shenyang110180月在南阳医学高等专科学校第一附属医院完成。1.3材料孕14-16dSD大鼠3只，3个月龄雄性SD大鼠20只，体质量200-250g，平均体质量为(225±25)g，均由同济医学院动物中心提供。将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组，每组10只。研究组大鼠颅脑损伤后进行神经干细胞脑实质内移植治疗，对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。1.4实验方法1.4.1颅脑损伤模型制作应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，将其固定在立体定向仪上，常规消毒铺巾，沿中线矢状切开头皮，剥离骨膜，显露右侧颅骨，用牙科钻在冠状缝和人字缝之间钻一直径5mm骨窗，保持硬膜完整，使用自由落体装置将