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第七章痘病毒科(Poxviridae)一、概述三、早、晚期转录二、痘病毒基因组结构四、痘病毒的繁殖（一）DNA末端的发夹结构五、重组痘苗病毒（二）DNA末端的倒置重复序列（一）重组痘苗病毒的基本原理（三）痘病毒基因组的保守区与变异区（二）进行重组痘苗病毒必要条件（四）我国痘苗病毒天坛株DNA结构的基本特征（三）几种可能的重组痘苗病毒活疫苗（五）痘病毒基因变异株（四）重组痘苗病毒表达活性多肽（六）痘病毒基因组的多肽编码区主要参考文献（七）痘苗病毒基因组表达调节的特点一、概述痘病毒科是一大群长方形或卵圆形病毒，长方形粒子长220～450nm，宽140～260nm，厚140～260nm。卵圆形粒子长250～300nm，直径160～190nm。病毒粒子由1个核心、2个侧体和2层脂质外膜组成，是动物病毒中体积最大、结构最复杂的病毒。痘病毒在宿主细胞的胞浆内增殖，这在DNA病毒是独特的。根据病毒的特征、自然宿主和特异性抗原，痘病毒分为两个亚科，即脊索动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科。脊索动物痘病毒亚科包括正痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属()、猪痘病毒属、副痘病毒属、软疣痘病毒属和牙塔病毒属等8个属。昆虫痘病毒亚科则只含昆虫痘病毒A、B、C3个亚属。各属内的成员可发生遗传性重组，各属间的成员则可发生非遗传性复活。目前仍有一些未定属的痘病毒(表7-1)。表7-1痘病毒科分类一、脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)1.正痘病毒属(Orthopoxvirus)牛痘病毒(Cowpoxvirus)天花病毒(Variolavirus)痘苗病毒(Vacciniavirus)兔痘病毒(Rabbitpoxvirus)小鼠传染性脱脚病病毒(Infectiousectromeliavirus)水牛痘病毒(Buffalopoxvirus)骆驼痘病毒(Camelpoxvirus)马痘病毒(Horsepoxvirus)猴痘病毒(Monkeypoxvirus)2.禽痘病毒属(Avipoxvirus)鸡痘病毒(Fowlpoxvirus)鸽痘病毒(Pigeonpoxvirus)火鸡痘病毒(Turkeypoxvirus)金丝雀痘病毒(Canarypoxvirus)麻雀痘病毒(Sparrowpoxvirus)燕八哥痘病毒(Starlingpoxvirus)鹌鹑痘病毒(Quailpoxvirus)雪鸡痘病毒(Juncopoxvirus)3.羊痘病毒属(Capripoxvirus)绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus)山羊痘病毒(Goatpoxvirus)疙瘩皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus)4.兔痘病毒属(Leporipoxvirus)粘液瘤病毒(Myxomavirus)兔纤维瘤病毒(Rabbitfibromavirus)野兔纤维瘤病毒(Harefibromavirus)松鼠纤维瘤病毒(Squirrelfibromavirus)5.猪痘病毒属(Suipoxvirus)猪痘病毒(Swinepoxvirus)6.副痘病毒属(Parapoxvirus)羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(Orfvirus)假牛痘病毒(Pseudocowpoxvirus)牛脓疱性口炎病毒(Bovinepustularstomatitisvirus)新西兰红鹿副痘病毒(ParapoxvirusofreddeerinNewZealand)7.软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)人传染性软疣病毒(Malluscumcontagiosumvirus)8.牙塔痘病毒属牙巴猴肿瘤痘病毒(Yabamonkeytumorvirus)塔那痘病毒(Tanapoxvirus)二、昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)昆虫痘病毒A属蛴螬(鞘翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒昆虫痘病毒B属摩氏蛾(鳞翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒昆虫痘病毒C属淡黄摇蚊(双翅目)昆虫痘病毒等昆虫痘病毒痘病毒引起人与多种动物包括禽类的疾病——由持续较长时间的轻症感染，至严重的致死性感染。除犬和猫不发生痘病毒感染外。几乎各种哺乳动物都有其各自的痘病毒，但某些痘病毒可以感染几种不同的动物。1.形态结构痘病毒具有独特的形态结构，电镜下为大型长方形(如正痘病毒)或卵圆形(如副痘病毒)颗粒。中央为一个两面凹陷的核心，两个侧体分别位于凹陷内。核心是由DNA和蛋白质组成的核蛋白复合体。紧帖于核心周围的是一层栅栏状的核心膜。核心和侧体一起，由脂蛋白性表面膜包围，其间充填着可溶性蛋白。正痘病毒等的表面膜显示许多小杆状或小球状单位；副痘病毒等的表面膜上则有规律性缠绕的螺旋丝(直径为10～20nm)。细胞外的病毒粒子，外面还有一层来自细胞的囊膜，囊膜内含有病毒特异的蛋白质，见图7-1。图7-1痘病毒的结构模式早期研究表明，提纯痘苗病毒粒子时用2-巯基乙醇进行处理，可使囊膜结构疏松，这可能是由于蛋白质二硫键被破坏的结果。如再加入非离子化去垢剂，则外膜破坏，核心与其相连的侧体释出。如果再用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理，更可使侧体从核心上脱落下来。加去氧胆酸钠、二硫苏糖醇和氯化钠于痘苗病毒的核心悬液中，可以使其破裂而释放出DNA和20%的蛋白质，以及包括许多溶解状态的酶类。其它正痘病毒，如禽痘病毒和兔痘病毒等的大小和形态结构基本相同，但羊痘病毒较小。昆虫痘病毒的形态差异较大。从Melolontha幼虫分离的昆虫痘病毒较大，直径为400×250nm，其表面有直径为22nm的球形结构，核心呈偏心肾形，只有单一侧体。从Amsacta幼虫分离的痘病毒较小，具有珠状表面结构，核心致密，核心周围缠绕着层中等密度的物质，侧体不明显。2.理化学特性病毒粒子的S20w约5000。在庶糖中的浮密度为1.25g/cm3，在氯化铯中约1.3g/cm3，痘苗病毒DNA的分子量为122×106，但鸡痘病毒的DNA分子量高达200×106。这样大分子量的DNA，可以编码几百种蛋白质。有关痘病毒的理化学特性的资料数据，主要来自痘苗病毒。该病毒的高度提纯制品含有92%蛋白质、3.2%DNA、1.2%胆固醇、2.1%磷脂、1.7%中性脂肪、0.2%非核酸碳水化合物以及微量的铜、核黄素和生物素。但鸡痘病毒的含脂量高达病毒粒子干重的34%。正痘病毒属和禽痘病毒属抗乙醚，副痘病毒属、羊痘病毒属和兔痘病毒属对乙醚敏感。痘病毒的耐乙醚程度看来取决于其所含脂类是否为必需的脂质。痘病毒的G+C含量甚低，只35%左右。已知痘病毒含有70多种早期蛋白质和40多种晚期蛋白质，分子量由8kDa～250kDa不等，一部分为糖蛋白和磷蛋白。应用非离子去垢剂和还原剂处理痘苗病毒粒子，可以使其外膜释出十几种主要多肽，如210kDa、110kDa、85kDa、42kDa、37kDa、21.5kDa、21kDa和20kDa，其中7种是糖蛋白。37kDa为主要蛋白，非糖基化。85kDa蛋白是血凝素(hemagglutinin,HA),HA-的痘苗病毒，其毒力显著降低。42kDa蛋白为穿膜蛋白。37kDa蛋白32kDa膜蛋白，此蛋白质能增强病毒对机体和宿主细胞的感染力；14kDa膜蛋白，则促进病毒与细胞以及细胞与细胞间的融合。糖蛋白对“胰蛋白酶消化”敏感，可能紧贴于病毒粒子表面之下，在用上述去垢剂和还原剂处理后，至少还有18种多肽不被释出，可能就是核心的结构蛋白，包括那些分子量和含量最多的多肽。在病毒粒子核心中74kDa、62kDa、25kDa和11kDa4种蛋白质，约占核心重量的70%，其中11kDa和25kDa蛋白对RNA有很高的亲和性。在病毒粒子核心中还有与核心DNA呈高度亲合性的60kDa、43kDa、28kDa、18kDa和14.5kDa5种蛋白质。痘病毒能在室温下耐受干燥几个月。于干燥条件下，可耐100℃5～10mins，但在潮湿条件下，60℃mins即可破坏之。对常用消毒剂具有较强抵抗力，但50%酒精和0.01%KMnO41hrs内使其灭活。于-70℃，可以存活多年。保存于50%甘油中的痘病毒，可于0℃以下温度中存活3～4年。3.增殖和培养痘苗病毒粒子对细胞膜的吸附过程较快，50%以上的种入病毒可于接种后的15mins内吸附于细胞，且无方向性，可以发生横向或纵向吸附。痘病毒虽然是DNA病毒，但它的整个增殖过程，全部在胞浆内进行。并在20hrs内完成一个复制周期。第一阶段，痘病毒粒子与细胞表面接触后，被细胞吞饮到吞饮泡内，在其中被水解酶系酶解，进行第一阶段脱壳(脱去外膜)，使病毒的核心等释放入胞浆。病毒粒子中存在有一整套用于自身增殖的酶，病毒脱去外膜后，在病毒RNA合成酶系作用下，占全病毒基因组近一半的拷贝被转录成早期mRNA。在核心内由依赖于DNA的RNA聚合酶、早期转录因子(ETF)、帽加工酶、甲基化酶、终止因子、聚(A)酶和磷酸酶等协同作用下，合成早期mRNA并很快释放入细胞质，并开始早期蛋白质的翻译，早期蛋白质的合成在病毒感染1～4hrs内进行。这种早期转录不受蛋白质合成抑制剂的影响。这些被翻译的70多种早期合成蛋白中的一些蛋白质作用于核心蛋白，进行第二阶段脱壳，使核蛋白和DNA相互分离。第二阶段为痘病毒DNA的复制和结构蛋白大量合成阶段。早期合成的蛋白中含有DNA聚合酶、胸苷激酶等与DNA复制相关的酶系。病毒DNA复制开始于DNA从核心蛋白分离的第二阶段脱壳期。由于DNA复制在病毒感染后2～5hrs开始，故在病毒感染后2～6hrs，在电镜下可见到胞浆内的“工厂区”。DNA的复制开始后，大部分早期蛋白质合成将停止，转入晚期mRNA的转录、大量结构蛋白的合成、少量其它病毒蛋白及少量酶的合成。早期和晚期mRNA含甲基化的末5’端，3’末端含有约100个腺苷酸残基。结构蛋白的合成阶段，DNA复制自然终止。但痘病毒的某些DNA复制发生于胞核，证明了细胞核在痘病毒增殖中的作用。第三阶段为病毒粒子成熟阶段。此阶段为多种合成成份组装成病毒粒子的过程。其中一部分多肽，进行糖基化、磷酸基化或断裂等修饰。超薄切片和电镜负染可以看到，成熟的病毒粒子核心为两层膜包裹了的DNA。在“工厂区”内出现月牙状脂质双层膜结构，凸面上有一层短的针状体。随后逐渐变为球形的闭合脂质双层膜，其中央腔内含有电子密度高的颗粒物质，最后出现清晰的核心和侧体，并且逐渐成熟。可见在细胞质内装配的成熟痘病毒具有重新合成的脂质双层膜，但与细胞膜无关。病毒粒子在出芽时仍可获得与感染细胞膜相关的脂质双层外膜，即囊膜。但尚不清楚病毒粒子是如何离开“工厂区”，运动至细胞周边的。除接触传染性脓疱性皮炎病毒以外，其它痘病毒易在其感染细胞内形成胞浆内包涵体。包涵体内含有病毒粒子，又称原生小体。现已清楚，只有一少部分病毒经出芽方式离开感染细胞，而大部分病毒粒子仍滞留在感染细胞内。一个感染细胞可产生10000个病毒粒子。利福平(rifampin)可阻断痘苗病毒外膜的形成和病毒粒子的聚集，而甲吲噻腙(methisazone)则阻断晚期蛋白质合成和病毒粒子的集聚。大多数痘病毒易在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，并产生溃烂的病灶、痘斑或结节性病灶。痘斑的形态和大小随病毒种类或毒株而不同。天花病毒和粘液瘤病毒引起小而分散的灰白色痘斑(白痘)。但痘苗病毒形成大而中心环死的痘斑，牛痘病毒和某些嗜神经性痘苗毒株产生中央出血性痘斑(红痘)。兔纤维瘤病毒在绒毛尿囊膜上引起极微小的病变，甚至难用肉眼见到。各种正痘病毒在鸡胚中生长的温度上界不同，例如猴痘病毒和鼠痘病毒为39℃，天花病毒为38.5℃，牛痘病毒为40℃，痘苗病毒和兔痘病毒为41℃。这些差别常被用于各种正痘病毒的鉴别。痘病毒易在组织培养细胞内增殖，并常产生明显的细胞病变或蚀斑。经常用于病毒培养的细胞有牛肾、兔肾细胞、HeLa细胞和鸡胚成纤维细胞等。感染正痘病毒的细胞经常具有血细胞吸附作用。4.血凝性正痘病毒的囊膜表面和感染细胞膜表面有血凝素蛋白，因此能够凝集火鸡红细胞和某些品种的鸡的红细胞。而禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒和副痘病毒均无血凝素蛋白。血凝素是分子量为85kDa和68kDa的糖蛋白，它具有N和O