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第十一章嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)一、概述二、正嗜肝DNA病毒属(一)土拨鼠肝炎病毒(WHV)(二)地松鼠肝炎病毒(GSHV)(三)树松鼠肝炎病毒(TSHV)三、禽嗜肝DNA病毒属(一)鸭乙型肝炎病毒(DHBV)(二)苍鹭乙型肝炎病毒(HHBV)主要参考文献一、概述很久以前人们就认识到肝炎是一种传染病，但直到上个世纪60年代末，才弄清乙型肝炎病毒(HBV)是传染性肝炎的一个重要病因。Dane等(1970)和Robinson等人对HBV的发现及其生物学特性鉴定做出了重要贡献。但由于该病毒宿主范围狭窄，又不能在培养的细胞中增殖，因而对其研究的进展不大。直到90年代以后，HBV感染动物模型的建立以及分子遗传学的诞生，尤其是HBV基因组克隆的成功，用克隆的HBVDNA可以进行体外转染试验，才使人们对HBV有了更清楚的了解。嗜肝DNA病毒科具有相似的病毒粒子结构和嗜肝特性以及明确的种属特异性。并可导致持续性病毒感染。HBV，WHV等可引起慢性活动性肝炎和原发性肝细胞癌。本科病毒与其他已知病毒科病毒的主要不同点，包括具有部分单链的双链DNA基因组、大量颗粒性囊膜抗原分泌到宿主血液中以及由反转录酶参与形成病毒粒子的独特复制机理等。1.分类现状嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)下设2个属：正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病毒属。详细分类情况见表11-1。近年来，在牛、马、羊、猪、鸡等多种动物体内检测到与嗜肝DNA病毒相关性抗原或类似的病毒粒子，但均未正式确定为独立的病毒种。表11-1.嗜肝DNA病毒科的分类现状科属代表株成员嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）正嗜肝DNA病毒属人乙型肝炎病毒(HBV)土拨鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus,WHV)地松鼠肝炎病毒(GroundSquirrelhepatitisvirus,GSHV)树松鼠肝炎病毒(TreeSquirrelhepatitisvirus,TSHV)禽嗜肝DNA病毒属鸭乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus,DHBV)苍鹭乙型肝炎病毒(HeronhepatitisBvirus,HHBV)2.形态结构本科病毒具有相似的病毒粒子结构。嗜肝DNA病毒完整的病毒粒子呈球型，直径40～49nm(禽嗜肝DNA病毒为45～65nm)。它由囊膜和核衣壳组成，囊膜厚7nm。携带乙肝病毒表面抗原（HBsAg），无表面突起；内部核衣壳呈二十面体对称，直径27～35nm(禽嗜肝DNA病毒为35～40nm)，有180个壳粒，以T=3对称排列。核衣壳内部含有一个环状DNA分子、DNA多聚酶、DNA结合蛋白以及蛋白激酶活性。核衣壳携带乙肝病毒核心抗原（HBcAg）；在慢性乙型肝炎患者或感染动物血清中，可见到无DNA的22nm左右的球型或纤维状脂蛋白颗粒。当血清中存在毒粒时，血清中还可发现一种与核衣壳有关的可溶性抗原，称为乙肝病毒e抗原（HBeAg）。外膜携带的HBsAg的抗原性比较复杂，有一个属特异性的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y”和“w/r”。“a”决定簇又可分为a1，a2，a3（Soulieretal1973）；“w”决定簇又可分为w1，w2，w3，w4（Bancroftetal1972;Holland1975），此外，尚有少见的亚型决定簇q、g、n、x和t（Feitelson1985）。其中最常见的主要血清型为adw、adr和ayw。亚型的地区分布不同（Gourouce—Pautyetal1983），我国以adr为主，adw次之。而新疆、西藏、内蒙等地区则以ayw为主。二、嗜肝DNA病毒基因组结构与功能嗜肝DNA病毒核酸为具有部分单链和部分双链的非共价闭合环状DNA分子，病毒粒子的分子量约为1.6×103～1.8×103kDa，沉降系数约15S；G+C含量48%。其中一条链(负链，与mRNA互补)具有全长序列(3.0～3.3kb)，另一条链(正链)长1.7～2.8kb不等，完全双链的克隆的DNA约3.2kb。长(负)链具有一个242bp缺口(在禽嗜肝DNA病毒为50bp)，其位置起始于短(正)链的5'端，两条链的5'端重迭240bp，通过粘端碱基配对保持DNA的环状构型。长链5'端具有共价结合的末端蛋白，病毒粒子核心具有DNA聚合酶/反转录酶，该酶利用短链DNA的3'端作为引物修复单链区以形成全长的双链分子。HBV病毒基因组有4个重迭或部分重迭的开放阅读框架(ORF)，它们均在长(负)链上，方向相同。一个ORF(S基因)编码主要的表面抗原(HBsAg)多肽(24kDa)，该基因前有一个“前S区”，带2个框内起始密码，它们是较少的33kDa和39kDaHBsAg多肽的起始位点。第二个ORF(C基因)编码主要的核心抗原(HBcAg)多肽(22kDa或21kDa)，该基因前有一“前C区”，编码29个氨基酸(aa)。最长的ORF(P基因)占整个基因组的80%，与其它三个ORF重迭，它编码反转录酶、病毒DNA聚合酶和RNaseH以及连接于基因组的末端蛋白。第四个ORF称为X基因，在体外转染试验中呈现反式作用活性，但自然感染中的作用尚不清楚。已知的WHV和GSHV均具有上述4个ORF，至少在WHV和GSHV，X基因对于病毒复制是必需的。DHBV缺乏X基因。三、病毒蛋白及其功能HBV囊膜由下述病毒编码的蛋白组成：S蛋白、M蛋白和L蛋白。病毒核心含有一种主要蛋白，P22或P21。2种主要S多肽分别为P24和GP27，它们的氨基酸组成相同，差别于GP27为糖基化的。M蛋白GP33和GP36由P24和N端另外55个氨基酸组成，差异在于糖基化的程度，它们具有“前S2”结构域。L蛋白P39和GP42比M蛋白再多出120个氨基酸，差异在于前者未糖基化，后者糖基化了，两者具有“前S1”和“前S2”结构域。嗜肝DNA病毒的特异性酶类包括蛋白激酶、依赖RNA的和依赖DNA的DNA聚合酶、RNaseH，以及共价结合到全长DNA链5'端的末端蛋白，可能起引发酶的作用。嗜肝DNA病毒的脂质(类)分布在表面抗原颗粒和完整病毒粒子中，它们可能来源于宿主细胞的粗面内质网，包括磷脂、固醇和脂肪酸。嗜肝DNA病毒的糖类成分主要是病毒囊膜中存在的NHBV主要有3种抗原:分别为HBsAg、HBcAg和HBeAg。HBsAg与中和性作用有关。HBsAg与WHV和GSHV的类似抗原(WHsAg和GSHsAg)间呈现一定的交叉反应，但与DHBV的类似抗原(DHBsAg)间无交叉反应。HBcAg为病毒核心的主要抗原。HBeAg是在病毒复制活跃时的宿主血清中检测到的一种可溶性蛋白(抗原)，它与HBcAg的大部分氨基酸序列相同，其羧基末端的149aa与HBcAg氨基末端相同，因此两者具有共同的抗原决定簇，但由于两者的氨基末端(HBeAg)和羧基末端(HBcAg)分别多出一段氨基酸序列，彼此又各有不同的抗原决定簇。HBcAg与WHV和GSHV的相应抗原(WHcAg和GSHcAg)的交叉反应比表面抗原间的交叉反应强。四、病毒的复制周期及分子感染机理在HBV感染人的肝脏中至少发现3种主要的RNA转录体，分别为3.4kb、2.4kb和2.1kb，它们具有不同的5'端(均有帽结构)和相似的3'端，最短的转录体(2.1kb)起始于前S区中段，比基因组还长的转录体(3.4kb)起始位点靠近C基因起始密码处。2.1kbmRNA和2.4kbmRNA似乎仅发现于表达HBsAg的细胞中，3种转录体均出现于支持病毒复制的细胞内。P39或GP42由2.4kbmRNA翻译产生，GP33或GP36由2.1kbmRNA翻译产生，P24或GP27由2.1kbmRNA和其它可能的2kb左右的mRNA翻译产生，C抗原由3.4kbmRNA翻译产生。其它嗜肝DNA病毒也具有类似的几种转录体。嗜肝DNA病毒的复制包括几个独特的步骤：产生共价闭合环状DNA分子(cccDNA)；合成较大的正链RNA(3.4kb)，包装入病毒核心颗粒中作为负链DNA合成的模板(反转录)；RNaseH酶切直接重复序列DR1和DR2后，存留的正链DNA5'端的转位作用引发以负链DNA为模板合成正链DNA。装配成成熟病毒粒子后，由细胞中释放出来。完整的HBV粒子和空心的HBV核衣壳的成熟部位似乎为感染肝细胞的核和胞浆。HBsAg仅在胞浆中和胞膜上检测到，但HBV成熟的确切机理尚缺乏可靠的证据。嗜肝DNA病毒呈现高度宿主特异性，例如，已知道HBV的唯一宿主是人，但黑猩猩和长臂猿可经实验感染。DHBV主要感染北京鸭，也可实验感染野鸭，但鸡和鹅等其它家禽对DHBV不敏感。嗜肝DNA病毒可存活于那些与感染者粘膜或皮肤创口接触的物品表面，如医疗、实验器材等。尽管曾有报道某些蚊虫和臭虫含有HBsAg，但尚无有关经昆虫载体传播的直接证据。二、正嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnavirus)正嗜肝DNA病毒包括所有哺乳动物嗜肝DNA病毒。其代表种是人乙型肝炎病毒(HBV)。由于HBV对人类的危害十分严重,对其研究已经非常细致。事实上，有关嗜肝DNA病毒的资料大多数来自于对HBV的研究。目前已经明确的正嗜肝DNA病毒属的动物病毒成员包括土拨鼠肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)。此外还有关于树松鼠肝炎病毒(TSHV)的报道。(一)土拨鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus)60至70年代,在美国费城动物园的一个土拨鼠(Marmotamonax)群中流行着一种类似人乙型肝炎的疾病。1977年5月，在该群的102例尸检的土拨鼠中发现23例原发性肝癌，平均59月龄(23～106月龄)。肝脏的典型特征为肝实质门区和窦状隙炎性细胞浸润，胆管、胆小管增生，肝细胞变性、坏死，并出现各种类型的炎性细胞。检测这些土拨鼠血清证实15%具有含DNA聚合酶的HBV样颗粒。这是土拨鼠肝炎病毒(WHV)的首次报道。在随后的调查中，发现土拨鼠中WHV的感染率极高。1978～1979年间在宾夕法尼亚东南部、新泽西中部和马里兰中北部捕获的217只土拨鼠中，WHV感染率分别为1978：7/51(13.7%)；1979：28/166(16.9%)。同时发现1979年捕获的166只土拨鼠中49只具有WHV抗体(29.5%)。1.形态特征WHV是继HBV后发现的第一个哺乳动物嗜肝DNA病毒，其形态特征与HBV十分相似。电镜可见3种不同的颗粒：一种为40～50nm的双层膜颗粒，它是完整的病毒粒子，相当于HBV的Dane颗粒；另一种为直径20～22nm的球形颗粒；第三种为直径20～22nm、长短不一的丝状颗粒。完整病毒粒子平均CsCl浮密度1.215g/cm3，另外有一个浮密度为1.196g/cm3的主要蛋白峰。2.理化学特性克隆的WHV基因组DNA约3.3kb，与HBV的核苷酸序列同源性为70%。SDS-PAGE分析表明，WHV表面抗原(WHsAg)有6种成分，分子量分别为22、25、35、37、39和42kDa。在慢性感染的土拨鼠肝脏中可检测到2个主要转录体，分别为2.1kb和3.7kb。2.1kbmRNA为S基因的主要转录体，编码WHsAg；3.7kbmRNA比WHV基因组DNA略大，可参与WHV所有蛋白质的表达，可编码WHV核心抗原(WHcAg)，同时作为反转录的模板，为前基因组RNA。3.培养特性免疫组织化学和超微结构分析WHV感染的土拨鼠肝组织发现WHsAg以微粒或包涵体形式存在于肝细胞浆中,WHsAg阳性细胞分布于肝小叶周围区。WHcAg主要位于细胞浆中，而不存在于核内(与HBcAg不同)。电镜检查提示在粗面内质网中有许多丝状结构(直径18～20nm)，无囊膜的核心颗粒(直径18～20nm)仅见于胞浆中。有囊膜的颗粒(直径42～45nm)见于粗面内质网腔内，它们与血清中见到的颗粒在形态上相同。这表明WHsAg主要在肝细胞浆中产生，并且似乎迅速装配成病毒粒子。由WHV感染的土拨鼠分离的外周血淋巴细胞带有低水平的非复制型WHVDNA。