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第十八章正粘病毒科(Orthomyxoviridae)一、概述主要参考文献一、概述流行性感冒病毒(以下简称流感病毒)的血凝素和神经氨酸酶对粘(糖)蛋白有亲和力，因此，原称为粘病毒，后统称为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，以与另一科病毒--副粘病毒相区别。甲型流感病毒的感染范围很广，常以流行的形式出现，发病急剧，蔓延迅速，危害很大。在1918年第一次世界大战结束时，流感大流行，席卷全世界，死于流感的人比战争本身死亡的还多。1933年，Smith等自人体分离出了甲型流感病毒。家畜和家禽的流感都是流感病毒引起的。Shope于1931年研究猪的流感，从猪体分离出一株病毒，将此种病毒接种易感猪后，使其发生了典型的猪流感。Sovinova和Waddell等先后从马体中分离出马甲1型和马甲2型两株马流感病毒。1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒核蛋白。乙型流感病毒发现于1940年，能引起人的呼吸道感染，但流行规模比甲型流感病毒小得多。丙型流感病毒也是感染人的病毒，但极少引起流行。1982年郭元吉等发现了猪的丙型流感病毒。1.分类现状与命名正粘病毒科中原来只有一个属，即流感病毒属。根据国际病毒分类委员会(ICTV)第6次分类报告(1995)将正粘病毒科由原来的一个流感病毒属分为三个病毒属：甲、乙型流感病毒属(InfluenzavirusA,B)；丙型流感病毒属(InfluenzaVirusC)；“类托高土病毒属”(“Thogoto－likeviruses”)。三个属的代表种分别为甲型流感病毒、丙型流感病毒、托高土病毒(Thogotovirus)。现将正粘病毒科的分类现状列表18-1。表18-1.正粘病毒科分类现状科属代表种成员正粘病毒科（orthomyxoviridae）甲、乙型流感病毒属(InfluenzavirusA,B)甲型流感病毒(InfluenzavirusA)丙型流感病毒属(InfluenzaVirusC)丙型流感病毒(InfluenzaVirusC)“类托高土病毒属”(“Thogoto-likevirus”)托高土病毒(Thogotovirus)有关流感病毒的分类与命名，世界卫生组织1971年推荐首先以病毒蛋白为依据，将其分为甲、乙、丙三型，再按表面抗原区分为血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的不同亚型。迄今已发现17种H亚型，包括人的H亚型4种(H0，H1，H2，H3)、马的H亚型2种(Heq1,Heq2)、猪的H亚型1种(Hsw1)和禽的H亚型10种(Hav1—10)；N亚型有10种，包括人的N亚型2种(N1，N2)、马的N亚型2种(Neq1,Neq2)和禽的N亚型6种(Nav1—6)。但在1980年，WHO专家小组又提出了甲型流感病毒新的分类和命名方法，将H分为16个亚型，N分为9个亚型，取消了过去使用的马(eq)、猪(sw)和禽(av)等抗原亚型符号，现将两种分类命名法对比列表18-2如下。表18-2.甲型流感病毒H和N亚型新旧命名法比较H亚型N亚型1980年命名H1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15H161971年命名H0，H1，Hsw1H2H3，Heq2,Hav7Hav4Hav5Hav6Heq1,Hav1Hav8Hav9Hav2Hav3Hav10Hav111980年命名N1N2N3N4N5N6N7N8N91971年命名N1N2Nav2,Nav3Nav4Nav5Nav1Neq1Neq2Nav6按照新的亚型命名方法、猪型、甲0型、甲1型和新甲1型都属同一亚型，即H1N1亚型，这样似乎体现不了我国甲型流感病毒的抗原性变异情况，因此本章有一些叙述中仍沿用我国对家畜流感病毒的习惯亚型名称，继续称为猪型、马甲1、马甲2型以及人的甲0、甲1、甲3和新甲1亚型等。根据1980年世界卫生组织公布的流感病毒命名方法，一株流感病毒名称中包括下面几项内容：型别/宿主/分离地点/毒株序号/分离年代(亚型)。如A/duck/Ireland/113/83(H5N8)，这是一株分离自鸭的甲型流感病毒，分离地点为爱尔兰，毒株序号为113，分离时间为1983年，亚型为H5N8。应说明的一点是，对从人分离的流感病毒，命名时可省略宿主项。如A/京科/1/56(H1N1)，A/HongKong/2/68(H3N2)。2.形态结构与化学组成典型的病毒粒子呈球状，直径80～120nm，平均为100nm。某些毒株，特别是在初次分离时，常呈丝状，丝状体长短不一，长者可达数微米。流感病毒的多形性，在动物病毒中是比较突出的。但是，不论长丝状或球形病毒粒子，其直径都相似。正粘病毒与副粘病毒有相似的特性，但又有区别，详细内容如表18-2。表18-1.正粘病毒科与副粘病毒科的区别特性正粘病毒副粘病毒病毒粒子大小80～120nm125～250nmRNA合成部位胞核胞浆基因组组成分节段不分节段转录需要引物是否附属核衣壳蛋白种类32囊膜与细胞融合的部位细胞内细胞表面基因重组的频率高无进化率高低病毒粒子从细胞膜芽生时获得病毒囊膜，囊膜内含有宿主细胞膜脂质，但缺乏宿主细胞的蛋白质。有两种不同型的囊膜纤突致密地镶嵌成规则的毛边样，一种是血凝素(H或HA)，是棒状的糖蛋白多聚体；另一种是神经氨酸酶(N或NA)，呈蘑菇状，亦为糖蛋白多聚体，但与某些正常细胞中神经氨酸酶完全不同。据统计，1个直径100nm的病毒粒子，平均约有500个纤突，包括HA和NA。其中HA约占90%，NA只占10%左右。图18-1禽流感病毒磷钨酸负染电子显微镜照片---自李成等图18-2马流感病毒(横杠=100nm)—自贾补年注意杆状和椭圆形等不同形态流感病毒(甲、乙型)的单链RNA由8个节段组成，丙型流感病毒仅7个RNA节段，一个RNA节段代表一个基因，这些节段以与核蛋白和转录酶结合的形式存在。流感病毒由68%～70%的蛋白质、1%～2%的核糖核酸(RNA)、20%～25%脂质和5%～8%的糖组成。病毒蛋白质含有5种多肽，即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和多聚酶。3．理化特性HA的存在使病毒能吸附在许多哺乳动物和禽类红细胞表面的糖蛋白受体上。这种结合在4℃条件下相当稳定；但在37℃时，由于NA对受体的破坏作用，使病毒迅速从红细胞上释放出来。流感病毒与其它螺旋样对称的有囊膜病毒一样，对干燥、冻融、脂溶剂的灭活作用极为敏感。二、正粘病毒基因组结构与功能甲、乙型流感病毒的基因组是由8个分节段的单链、负股RNA组成，其中4、6号两个节段编码病毒囊膜糖蛋白。而丙型流感病毒仅编码单一表面糖蛋白，因而丙型流感病毒的基因组由7个RNA节段组成。流感病毒基因组节段具有共同的特点：所有的RNA节段均具有相同的5’端，它由13个核苷酸所组成；3’端由12个高度保守的核苷酸组成，靠近3’端的第四个碱基，有些毒株为U，有的为C。在这些共同序列中，有部分序列可反向互补，这一点对病毒RNA的复制很重要；在每一节段靠近5’端15～21核苷酸处有一保守区，其序列为poly(U)。这一保守区在病毒mRNA合成时是产生poly（A）的信号。因为每一RNA节段的3’和5’端有部分序列互补,所以每个RNA节段呈锅柄环状。第1～6个节段各编码一个病毒蛋白，7、8节段各编码2个病毒蛋白，这样甲、乙型流感病毒具有10种蛋白多肽。理论上，丙型流感病毒应具有9种蛋白多肽，可目前仅证实8种。不同节段基因负责编码不同的蛋白，具体见表18-3。由于流感病毒的基因组分节段的结构特点，导致了基因组的易变性和具有很高的重组率。流感病毒RNA总分子量为5.9×106～6.3×106。甲、乙和丙型流感病毒基因组的大小和碱基组成不尽相同，AU∶GC的比率甲型为1.25；乙型为1.42；丙型为1.46。提纯的流感病毒RNA不具有感染性，需与一些具有多聚酶活性的蛋白结合在一起才具有感染性。表18-3.流感病毒RNA节段编码蛋白质片段序号流感病毒编码蛋白甲流感病毒乙流感病毒丙流感病毒1PB2PB1P12PB1PB2P23PAHAP34HAHAHE5NPNPNP6NANA，NB7M1，M2M1，M2M8NS1,NS2NS1,NS2NS1,NS2三、病毒蛋白及其功能1．核蛋白(NP)流感病毒的核蛋白，分子量约60kDa，是单体磷酸化的多肽，是构成核衣壳的主要成分。核蛋白具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型，它是可用补体结合试验方法测定的型特异抗原，即可溶性抗原。它没有感染性，在病毒粒子内部卷曲成螺旋状结构，是病毒核酸外面的一种蛋白质，但它并不把核酸完全包被起来，因而核衣壳仍对核糖核酸酶敏感。核糖核酸被酶裂解后，核蛋白亚单位仍然存在，推测核蛋白自身形成一种内聚结构。核蛋白是一种多功能蛋白质，除了形成病毒的核衣壳外，在病毒基因组的转录和复制中也可能起作用。在确定病毒的宿主特异性方面也有作用，例如根据对许多流感病毒NP基因的研究，可将它们分为5个不同的组，所有的禽流感病毒分为两个组，马流感病毒分为两个组，猪流感病毒分在一个组。核蛋白的磷酸化取决于宿主细胞，与病毒感染的宿主谱有关。核蛋白分子至少具有3个独立的抗原位点，借助于单克隆抗体和多克隆抗体进行研究，发现所有被测毒株都有一个共同位点，针对这一位点的单抗可抑制病毒RNA分子的体外转录。针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供被动保护，用提纯的NP免疫动物，也只能产生很微弱的抗感染能力，但NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。2．基质蛋白(matrixproteins,MA)基质蛋白是一种非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA节段、丙型流感病毒的6RNA节段编码。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的内侧，也称为内膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。片段7或6有两个读码框架，可转录出两个mRNA，分别翻译出一种蛋白质。因此流感病毒的基质蛋白有两种，即M1和M2。M1由252个氨基酸残基组成，分子量约26kDa，它是病毒的主要结构蛋白，占流感病毒蛋白总量的40%。这种蛋白也具有型特异性，其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一。M1位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧，是维持病毒形态的结构蛋白。另外M1还可在感染细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上发现。研究表明，M1的氨基端含有一亲水区，羧基端与病毒的转录酶之间相互作用。流感病毒的M1具有多种功能，除维持病毒粒子的形态外，还能调节病毒转录酶的活性，另外在子代病毒粒子装配过程中也起重要作用。据报道，M1单克隆抗体不能给动物提供被动保护。M2由97个氨基酸残基组成，分子量大约为15kDa，由片段7转录的第二个小mRNA翻译出。M2也是一种跨膜蛋白，主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上，另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。每个病毒粒子大约含有14～68个M2分子。流感病毒M2的主要作用是在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的pH值；在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境；另外在病毒装配过程中也起作用。流感病毒M2的氨基酸序列很保守，在所检测的毒株中，其同源性高达90%。这种蛋白在感染细胞的细胞膜上与I类糖蛋白相似，即氨基端在细胞外，羧基端在细胞内。细胞外部分为18～23个氨基酸，19个氨基酸残基组成的疏水区插入细胞膜内，羧基端的54个氨基酸位于细胞质内。氨基端的10个氨基酸非常保守，在所测的禽流感和人流感病毒中，其序列几乎完全相同。研究表明，针对M2氨基端的单克隆抗体可抑制病毒蚀斑的增大，其作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同。用这种单抗筛选突变株时，不仅引起M2的突变，还能引起M1的突变。3．聚合酶(polymerase)流感病毒的聚合酶由三种成分组成，它们是PB1、PB2、PA。这三种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质，分别为96kDa，87kDa，85kDa。这三种蛋白质在氨基酸序列上有一共同特点，都含有一特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。所以在感染细胞的细胞核内都可发现这三种蛋白成分。流感病毒聚合酶复合体在病毒粒子中所处的位置目前已经清楚。三种蛋白质位于病毒基因组的3’末端，