第2章核酸的结构和功能

第2章核酸的结构和功能1、主要内容1)核酸的化学组成和结构2)核酸的物理化学性质3)核酸的光谱和热性质4)DNA超螺旋2、教学要求1)掌握DNA双螺旋结构特点，核酸的变性、复性和分子杂交原理；2)熟悉核酸的物理化学性质3)了解三股螺旋DNA第1节细胞的遗传物质第2节核酸的化学组成第3节核酸的结构第4节核酸的物理化学性质第5节超螺旋和拓扑异构第1节细胞的遗传物质一、DNA携带两类不同的遗传信息1.遗传物质必须具有的特性a.贮存并表达遗传信息b.能把信息传递给子代c.物理和化学性质稳定d.具有遗传变化的能力DNA的特征a)各异的碱基序列储存大量的遗传信息b)碱基互补是其复制、转录表达遗传信息的基础c)生理状态下物理、化学性质稳定d)有突变和修复能力，可稳定遗传是生物进化的基础2、DNA携带两种遗传信息a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、rRNA)：64个三联体密码子：3个终止密码子，编码氨基酸的61个密码子具有简并性、通用性b、编码基因选择性表达的信息原核生物的结构基因占Genome的比例很大，Φx174phage5386bp，结构基因用去5169bp比例达96％。真核生物的结构基因占Genome的比例很小，哺乳动物中结构基因只占10％～15％。其余80％以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息。表现在：细胞周期的不同时相中个体发育不同阶段不同的器官和组织不同的外界环境下各种基因的表达与否以及量的差异所以又称－－调控序列二、RNA也可作为遗传物质RNA病毒：传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳）TobaccoMosaicVirus(TMV)类病毒（viroid）:使高等植物产生疾病的传染性因子，只由RNA组成。三、是否存在核酸以外的遗传物质Prion(proteinaccousinfectionsparticle)引起的风波朊病毒－－－蛋白质样的感染因子1)羊搔痒病(scripie)2)人类库鲁（kuru）病3)牛海绵状脑炎(疯牛病)均由传染性病原蛋白颗粒引起，统称Prion(朊病毒)资料：1982年，美国加利福尼亚大学教授斯坦利?普利西纳提出雅克氏病的病原体是一种“蛋白质性质的感染颗粒”，并用prion（普利昂）一词表示这种因子，国内曾译为朊病毒或锯蛋白。但这种蛋白质粒子缺乏核酸，称为病毒并不妥当，故现在称为朊毒体。疯羊病、疯牛病及人类所患的新型雅克氏症等海绵状脑病，都是由朊毒体发生变异引起的。包括人在内的哺乳动物体内都存在朊毒体，它在正常形态下呈折叠状，但变异时会张开如同锯齿状，在大脑中撑出大量的小洞，引起人或动物患上痴呆型的传染性海绵状脑病。朊毒体的致病过程是：首先经一定传播途径（如进食患病动物的肉和内脏）侵入机体并进入脑组织，其后沉积于不同的神经元溶酶体内，导致被感染的脑细胞受损、坏死，释出的朊毒体又侵犯其它脑细胞，使病变不断发展；病变的神经细胞死亡后，脑组织中留下大量小孔呈海绵状，并出现相应的临床症状，这就是众所周知的海绵状脑病。普利西纳学说公布之初，在学术界曾遭到猛烈反对，多数人持否定态度。因为分子生物学的中心命题是“生物的遗传基因以核糖核酸和脱氧核糖核酸为本体”，在此之前，人们普遍认为，不存在没有核酸的病原体，这已成为常识，但普利西纳的学说却与这种认识背道而驰。经过10多年的研究和争论，大量事实确证了朊毒体的存在，普利西纳的学说最终得到了认可。鉴于这一发现的重大科学价值，普利西纳荣获1997年度诺贝尔生理学或医学奖。第2节核酸的化学组成一、含氮碱基、核苷、核苷酸DNAisanucleotidepolymerwithcovalentbondsbetweenthesugarandPhosphategroups.Alongmolecularchaincontainingasugar,aphosphateandoneoffourdifferentnucleotidebases.ChemicalComposition（化学组成）:Sugar(糖):Deoxyribose(ribose核糖inRNA)Phosphate(磷酸):-phosphodiesterBases(碱基):(G)guanine(C)cytosine(A)adenine(T)thymine☉碱基名称与缩写(1)RNA：ribonucleicacid核糖核酸DNA：deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸pyrimidine：cytosine(Cyt)胞嘧啶嘧啶thymine(Thy)胸腺嘧啶uracil(Ura)尿嘧啶purine：adenine(Ade)腺嘌呤嘌呤guanine(Gua)鸟嘌呤名称与缩写(2)ribonucleoside核糖核苷（不带磷酸）adenosine(Ado)腺(嘌呤核)苷guanosine(Guo)鸟(嘌呤核)苷cytidine(Cyd)胞(嘧啶核)苷thymidine(Thd)胸(腺嘧啶脱氧核)苷uridine(Urd)尿(嘧啶核)苷ribonucleotide核糖核苷酸（带磷酸）adenosine5’-mono(di,tri)phosphaste；AMP,ADP,ATPdeoxyribonucleoside脱氧核糖核苷deoxyadenosine(dAdo)……deoxyribonucleotide脱氧核糖核苷酸dAMP,dADP,dATP……dNTP二、DNA分子的一级结构1.多聚核苷酸链主链是核糖和磷酸，侧链为碱基，由3’,5’磷酸二酯键连接2.链的方向：同一个磷酸基的5’酯键到3’酯键的方向(5’→3’)3、DNA一级结构的特点a.脱氧核糖是其显著特点－－－－DNA极其稳定的根本原因b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平面的c、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子,这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象。4、一级结构的概念指DNA分子中的核苷酸排列顺序不同生物借此贮存遗传信息决定DNA的二级结构和高级结构第3节核酸的结构一、DNA双螺旋模型的提出依据a.1938.W.T.Astbury首次用X－射线分析DNAb.1950ChargaffA+G/T+C=1A+T≠G+Cc.1952AlexanderTodd发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接d.1952M.H.F.Wilkins&RosalindFranklin得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（2nm)。Watson-Crick的DNA双螺旋两条相互独立的单链DNA分子以螺旋方式相互缠绕，形成右手双螺旋；带有负电的戊糖-磷酸骨架在分子的外侧；碱基则平面堆积于螺旋的内部；由于骨架双链在螺旋轴上的间距不相等，从而在分子表面形成大沟和小沟。双螺旋模型参数直径20Å螺距为34Å(任一条链绕轴一周所升降的距离)每圈有10个核苷酸(碱基)两个碱基之间的垂直距离是3.4Å。螺旋转角是36度。有大沟和小沟，配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称。二、影响双螺旋结构稳定性的因素范德华力（Vandewaalsforce）疏水作用力(Hydrophobicinteraction)*不稳定因素磷酸基团间的静电斥力碱基内能增加(温度),使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱三、双螺旋结构的基本形式图B-DNA：资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维。此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋Z构象等形式。DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象。原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键，磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键。四、一些DNA序列的不寻常结构1、反向重复序列与二级结构反向重复序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeats,IR）,又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向。有时也有不完全相同的情况。RNA和DNA中都可能存在此外还可有directedrepeatitivesequence---正向重复序列较短的回文序列可能是作为一种信号如：限制性内切酶的识别位点一些调控蛋白的识别位点例如限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点5‘－－GAATTC－－3’3‘－－CTTAAG－－5’2.三螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)（1）发现和证实1953年，Watson&CrickD.SDNAmodel证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体潜在的专一与DNA(蛋白质)结合的能力形成T.SDNA可能性1957年Felsenfeld等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链如：polyA/polyUpolydA/polydTpolyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出1987年Mirkin.S.M证明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在，这些发现促进了三螺旋DNA的研究（2）组成形式a、D.S.DNA+D.S.DNA→T.S.DNA+S.S.DNAb、分子组成☆PY/PU+PU(偏碱性介质中稳定)G＊G、A＊A、G＊C＋☆PY/PU+PY(偏酸性介质中稳定)常见类型G＊C＋A＊T3、四股螺旋DNA(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA结构特点：基本结构单元－－鸟嘌呤四联体可能的功能：A、稳定真核生物染色体结构B、保证DNA末端准确复制C、与DNA分子的组装有关D、与染色体的meiosis&mitosis有关第四节核酸的物理化学性质DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征，也是DNA研究中一些实验技术的基础1、条件：加热，极端pH，有机溶剂（尿素、酰胺)，低盐浓度等2、变性过程的表现¤是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围¤导致一些理化性质发生剧烈变化3、熔解曲线与Tm值缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到0.1℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线。Tm=℃ofCt=C0/2=OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)或DNA双螺旋结构失去一半时的温度这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94℃的原因。4、影响Tm值的因素（1）在A,T,C,G随机分布的情况下，决定于GC含量GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小（2）GC%含量相同的情况下AT形成变性核心，变性加快，Tm值小。碱基排列对Tm值具有明显影响生物体内仅UAA为最有效的终止密码子因为：UAA、AUU的Tm值是最低的一个，即使生理温度下也不稳定。二、DNA分子的复性（annealorrenaturation）概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火）。根据复性动力学公式我们可以知道什么？(1)单链浓度随着时间的增大而减小；(2)反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3)以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线;(4)通过COt1/2值可测原核生物基因组的大小;已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp,COt1/2=9M.Sec则(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同;(6)可用以区分真核生物和原核生物基因组。在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些法来检测？(1)减色效应（hpochromiceffcef）测定光密度，即OD值(opticaldensity），DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2)羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链。四、核酸分子杂交（hybridization）※杂交形式：液相杂交固相杂